【正文】 分別用 40％、 60％、 80％乙醇定容，然后分別在超聲清洗儀中超聲 90、 60、 120min。 超聲提取次數(shù)的影響 1 2 3 4 5超聲次數(shù)金絲桃素含量（％） 圖 36 提取次數(shù)的選擇 The determination of distill times 從結(jié)果看，一次提取后金絲桃素基本被完全提取出來，因此只需提取一次即可。合并各次提取液，補加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測金絲桃素的含量，計算提取物中金絲桃素純度。補加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測金絲桃素的含量，計算提取物中金絲桃素純度。流動相為 甲醇 Na2HPO4（ H3PO4調(diào) ） =7:1，檢測波長為 590nm，柱溫為 30℃ ，流速為 ，結(jié)果圖譜中金絲桃素和偽金絲桃素峰形尖銳，無拖尾現(xiàn)象，分離效果良好，保留分別為 和 。 精密度試驗 表 25 偽金絲桃素精密度試驗結(jié)果 The result of precision test 次數(shù) 峰面積 測得 量 （ μg） 標準偏差 1 2 平均值 3 4 5 6 RSD（％） 7 表 25 為偽金絲桃素精密度試驗結(jié)果， RSD 為 %，說明該方法精密度良好。由圖 27 得到金絲桃素的線性回歸方程：Y=+ R2=。b: petroleum benzene: acetic ether: methanol:=5:20:2。 結(jié)果與討論 金絲桃素及偽金絲桃素的定性分析 展開劑的選擇 實驗中嘗試采用幾種較常用的展開劑組合，如氯仿 甲醇體系，石油醚 乙酸乙酯體系、石油醚 丙酮體系 、正丁醇 丙酮體系、氯仿 乙醇，二氯甲烷 甲醇，石油醚 乙酸乙酯 甲醇 體系 ，分別采用不同的比例進行實驗， 結(jié)果氯仿 甲醇 ，石油醚 乙酸乙酯 甲醇，二氯甲烷 甲醇體系 能夠有效的分離金絲桃素和偽金絲桃素。 精密度試驗 以濃度為 ，連續(xù)進樣 5 次，進樣量為 5μl，測定峰面積，計算相對標準偏差。 精密度試驗 以濃度為 ，連續(xù)進樣 5次，進樣量為 15μl，測定峰面積，計算相對標準偏差。 精密稱取偽金絲桃素標準品 ，置 1ml容量瓶中，以色譜純甲醇溶解，超聲 30min，冷卻 后定容 ， 避光保存，為儲備液 ，濃度為 。本論文 嘗試 建立一種簡單有效的方法對貫葉連翹中的金絲桃素進行連續(xù)提取分離，獲得高含量的金絲桃素提取物。該植物提取物已被 FDA批準為食品添加劑，并收入德國 、 英國 、 法國等國藥典。 制備高效液相色譜根據(jù)待分離樣品的負載量可分為兩類，一類為研究開發(fā)型，另 一類為工業(yè)生產(chǎn)型。這樣混合物就按分子量由大到小先后流出并得到分離。作為一類不同于離子交換樹脂的吸附和篩選性能相結(jié)合的分離材料，其化學結(jié)構(gòu)不帶或帶有不同極性的功能基，根據(jù)樹脂的表面性質(zhì)，可分為非極性、中極性和極性三類。缺點是微波提取生產(chǎn)線微波裝機功率較大、制造難度高，提取生產(chǎn)線只能分批次作業(yè)，加料、進液、出液、出渣等輔助時間較長，降低了整機利用率。國外微波萃取設備用螺旋管方式較為普遍。 （ 7）酚類物質(zhì)提取 許多植物和中藥材中包含這各種酚類化合 物，如簡單的酚類、酚酸、花青素衍生物、羥基苯丙烯酸衍生物等，這些物質(zhì)都具有自由基捕獲的功能，具有制成抗氧化劑食品的潛力，因此近年來吸引了相當多化學、食品、醫(yī)藥行業(yè)的研究人員對此進行研究。 Chen Y等 [69]采用微波提取、振蕩提取、加熱回流提取、超臨界提取以及超聲波提取技術從林芝中提取總?cè)剖皆碥眨囼灠l(fā)現(xiàn)微波提取只需要 5min 就可達到最高的產(chǎn)率 %，而其他的方法至少也要幾個小時，有的甚至十幾個小時，產(chǎn)率卻更低。有的生物堿可用來制作農(nóng)業(yè)用的殺蟲劑。陳燕芬 [63]等以乙醇作為提取溶劑，采用微波技術和加熱回流法提取決明子中的大黃素，與常規(guī)回流加熱法相比，微波提取法大大縮短了提取時間，提高了提取效率。施英等 [59]微波輔助法從蠶蛹蟲草中提取多糖的適宜條件為： 微波功率 600W，料液比 1:20，提取時間 20min。沒有高溫熱源，消除了熱梯度，從而使提取質(zhì)量大大提高，有效地保護食品、藥品以及其他化工物料中的功能成分。 微波提取 提取法 微波提取 的原理 微波提取技術 (Microwaveassisted Extraction Technique, MAE)是利用微波能來提高提取率的一種最新發(fā)展起來的新技術，自從 1986年 Ganzler 等 [54]首次利用微波爐從棉仔中提取出棉酚，發(fā)現(xiàn)其提取效率大大高于傳統(tǒng)的索氏提取和超聲提取方法后，微波提取技術迎來了其發(fā)展的春天。正是超聲波產(chǎn)生的這種極端條件對提取過程進行強化。治療組中有 81％的病人感覺好轉(zhuǎn)，而安慰劑組只有 50％的病人感覺好轉(zhuǎn)，且耐藥性良好 [52]。 Jacobson 等 [49]進行了合成 HY 治療慢性丙型肝炎病人的Ⅰ期臨床觀察，驗證 HY的安全性和抗病毒活性，結(jié)果表明，合成的金絲桃素在臨床上抗 HCV的效果并不理想，患者體內(nèi)沒有檢測到抗 HCV活性，且高劑量組出現(xiàn)了光毒性。國內(nèi)也有相關報道，有人用小鼠尾懸掛實驗和大鼠強迫游泳實驗模型以及損壞大鼠腦嗅球動物模型對含金絲桃素的貫葉連翹提取物的抗抑郁作用進行研究，結(jié)果表明貫葉連翹提取物有明顯的抗抑郁作用。 鄭莉等 [40]測定藥物對小鼠腦組織內(nèi)的單胺氧化酶 A和 （ MAOA和 MAOB） 的活性及用 HPLC電化學檢測器測定大鼠紋狀體和前腦邊緣區(qū)的單胺遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量 ， 研究結(jié)果表明貫葉連翹提取物可能是通過抑制單胺氧化酶以及抑制單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的攝取而發(fā)揮抗抑郁作用的。 目前 PDT主要 適合用于小型和表面腫瘤 的治療， 也 被 應用于 多數(shù) 腫瘤手術的輔助治療 [32,33]。在尋找替代光敏物質(zhì)的過程中，金絲桃 素以顯著的抗病毒活性和光動機理引起人們的注意。在檢測器的選擇上，多采用二極管陣列檢測器，在 589 nm 左右進行檢識 [26]。目前報道所采用的展開劑均不盡相同，如談增毅等 [22]采用的展開劑為乙酸乙酯丁酮 甲酸 水（ 5:3:1:1）；溫普紅等 [23]采用的展開劑為石油醚 :乙酸乙酯 :甲醇＝ 1:4:3。 大孔吸附樹脂法 采用大孔吸附樹脂 D101 處理貫葉連翹醇提物 [19]， 80%的乙醇上樣使金絲桃素吸附在大孔樹脂上，以 40%乙醇洗脫可以除去大量雜質(zhì)， 80%乙醇可以解吸吸附樹脂柱上的金絲桃素，產(chǎn)品中總金絲桃素含量可達 %，提取率為 %。 金絲桃素的提取與純化 目前國際市場上所售的貫葉連翹提取物，均以金絲桃素的含量為標準，其含量要求大于等于 %。 （ 3） 間苯三酚衍生物 也就是藤黃酚類衍生物，主要是間苯三酚的異戊二烯的衍生物組成。 植物中還存在偽金 絲桃素的氧化產(chǎn)物環(huán)偽金絲桃素（ Cyclopseudohypericin）。 貫葉連翹的化學成分 由于貫葉連翹具有重要的藥理作用，故其化學成分的研究也一直是熱點，國內(nèi)外學者對此進行了大量的研究。單葉生，葉無柄，彼此靠近密集，橢圓形至線形，長 1～ 2 厘米，寬 ～ 厘米，背卷，上面綠色，下面白綠色，全面散布透明或黑色的腺點，黑色腺點大多分布于葉片邊緣或近頂端。美國醫(yī)生在十九世紀和二十世紀用其治療歇斯底里癥和因抑郁而產(chǎn)生的各種神經(jīng)癥狀。在德國將其用于抗抑郁藥也有近百年的歷史?；ㄐ驗榫蹅銧罨ㄐ?，生于莖及分枝兩端。 貫葉連翹的主要化學成分已被分離鑒定，一般認為其主要成分包括：黃酮類化合物（ flavonol glycosides）、萘駢二蒽酮類化合物（ naphtodianthrones）、間苯三酚衍生物（ pholoroglucinols derivatives）、揮發(fā)油以及有機酸等其它成分 [4]。 （ 2）黃酮類化合物 目前研究表明貫葉連翹中的黃酮類化合物主要有蘆?。?Rutin）、金絲桃苷（ Hyeroside）、異槲皮苷（ Isoquercitrin）、槲皮苷（ Quercitrin）、槲皮素（ Quercetin）等，分子結(jié)構(gòu)式見圖 13[7,8]。目前研究表明，貫葉連翹中藤黃酚衍生物主要有貫葉金絲桃素（ Hyperforin）、加貫葉金絲桃（ Adhyperforin） ， 分子結(jié)構(gòu)式見圖 14[5]。國內(nèi)目前提取金絲桃素通常采用醇提取法和堿液提取法，另外最近有報道采用超臨界 CO2提取法和大孔樹脂提取法等新方法。 超臨界 CO2流體萃取法 采用超臨界 CO2流體萃取法 [20]，通過對條件進行優(yōu)化得到的最優(yōu)條件：萃取壓力 27MPa、溫度 60℃，解析釜Ⅰ壓力 14MPa、溫度 64℃，解析釜Ⅱ壓力 6MPa、溫度 50℃， CO2 流量為25 kg/kg原料 定量分析 （ 1） 分光光度法 張健等 [24]采用分光光度法在 589 nm 波長下測定了貫葉連翹甲醇提取物中的總金絲桃素的含量。 （ 3） 差示脈沖極譜法 差示脈沖極譜法被用于檢測樣品中的總金絲桃素（包括金絲桃素、偽金絲桃素、原金絲桃素和原偽金絲桃素）的含量。 金絲桃素是目前自然界中發(fā)現(xiàn)的最有效地光敏劑。由于金絲桃素 PDT 作用的光依賴性，使其成為 易于光照的皮膚 腫瘤的理想的有效治療方法。但是隨后的研究發(fā)現(xiàn)貫葉連翹提取物在 4~10mol/l 的濃度時抑制 MAO 活性的 27％，而金絲桃素在同樣濃度下只抑制活性的 2％ [41]， 研究證明貫葉連翹中黃酮類成分能抑制 MAO 的作用，貫葉金絲桃素抑制 5HT， DA， NA等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和 γ 氨基丁酸 （ GABA）， L谷氨酸等氨基酸類神經(jīng) 遞質(zhì)的重吸收，而金絲桃素抑制 mACHR 和 sigma 等神經(jīng)受體的作用 [42,43]。 抗 病毒 現(xiàn)有的研究表明，金絲桃素及偽金絲桃素在體內(nèi)外都有很強的抗病毒活性，可以抑制多種逆轉(zhuǎn)錄病毒 [46,47]，包括人體免疫缺陷病毒（ HIV）、 牛免疫缺陷病毒（ BIV）、鼠白血病病毒（ LPBM5）和高致病性的禽流感病毒（ H5N1 和 H9N2）等，以及多種包膜病毒，如乙肝病毒（ HBV）、丙肝病毒（ HCV）、Ⅰ型單純皰疹病毒（ HSV1）、流感病毒 A1（ Brazil）、鼠巨噬細 胞病毒（ MCMV）和辛德比病毒（ Sindbis virus）等。 目前 由中國農(nóng)科院蘭州畜牧獸醫(yī)研究所和農(nóng)業(yè)部新獸藥重點實驗室研制的 金絲桃素制劑已被作為抗禽流感的藥物投放疫區(qū)， 疫區(qū) 養(yǎng)雞場和農(nóng)戶使用含有金絲桃素的飼料 15天后，沒有發(fā)生雞只病死及感染禽流感現(xiàn)象，而各未用藥區(qū)陸續(xù)仍有雞只感染，固證實在飼料中應用金絲桃素能有效的預防禽流感的發(fā)生，經(jīng)金絲桃素對禽流感 H5N H9N2亞型病毒的殺滅效果試驗表明，殺滅率高達 %以上。 （ 3） 創(chuàng)傷治療（ Wound Healing） 貫葉連翹作為創(chuàng)傷治療的藥物已有很久的歷史，一項對人的研究證實了其在創(chuàng)傷治療方面的效力。 同時 ，超聲波產(chǎn)生的振動作用加強了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散及溶解 。 MAE 的原理在學術界有許多不同的描述，其最基本的理論還是以微波穿透性加熱的原理為基礎，即微波對物料進行立體加熱，而 常規(guī)方法大多為平面加熱。 （ 2） 節(jié)約時間 由于微波可以穿透式加熱，提取的時間大大節(jié)省。在此實驗條件下微波提取蠶蛹蟲草多糖具有提取率高、提取速度快、原料耗費少、處理簡單等優(yōu)點，是從蠶蛹蟲草中提取多糖的一種較好的工藝方法。胡秀麗等 [64]研究了大黃總蒽醌的微波輔助提取、超聲提取和索氏提取方法，并利用分光光度法測定了提取液中總蒽醌的含量。人們在脊椎動物和無脊椎動物體內(nèi)也分離到了生物堿，其中某些動物的生物堿與它們報攝取食用的植物有關，蟾蜍、蠑螈和某些魚類中發(fā)現(xiàn)的生物堿是真正的動物代謝產(chǎn)物。 （ 6） 揮發(fā)油提取 揮發(fā)油又稱精油（ Essential Oils），是一類具有揮發(fā)性可隨水蒸汽蒸餾出來的油狀 液體，大部分具有香氣，如薄荷油、丁香油等。 Pan Y M等 [72]利用微波提取和索氏提取從龍眼皮中提取多酚類物質(zhì)，微波提取在 80℃， 500W、提取 30min，含量可達到 mg/g，而索氏提取 2h才達到 mg/g。由于微波穿透深度有限， 2450MHz 頻率的微波系統(tǒng)采用管道直徑均在 3～ 6 公分之間。需要指出的是微波穿透深度有限，微波提取設備必須配備攪拌器，實現(xiàn)動態(tài)提取。非極性吸附樹脂是由偶極距很小的單體聚合制得的不帶任何功能基，孔表的疏水性較強，可通過與小分子內(nèi)的疏水部分的作用吸附溶液中的有機物，最適于由極性溶劑（如水）中吸附非極性物質(zhì)。 羥丙基葡聚糖凝膠 羥丙基葡聚糖凝膠是 Sephadex G25 經(jīng)羥丙基化處理后的產(chǎn)物。研究開發(fā)型高效液相制備色譜屬于實驗室規(guī)模的制備分離，樣品量為微克級至克級，分離的樣品一般供生物活性測試、結(jié)構(gòu)鑒定以及作為標準品等。金絲桃素的多種藥理作用，使其成為當前國際研究開發(fā)的熱點課題之一。 本文研究的主要內(nèi)容 （ 1） 研究 貫葉連翹中主要藥理成分金絲桃素 、 偽金絲桃素 、蘆丁、金絲桃苷 的定性與定量檢測方法，并對其 HPLC 定量檢測方法進行方法 學研究 ； （ 2） 研究超聲提取法在金絲桃素提取中應用的可行性，從溶劑的種類、溶劑濃度、冷浸時間、超聲提取時間、超聲提取液固比、超聲提取次數(shù)幾個方面考察對提取物中金絲桃素純度的影響； （ 3） 篩選大孔 吸附 樹脂，研究大孔 吸附 樹脂分離金絲桃素的工藝條件 ；