【正文】 、蘆丁、金絲桃苷 的定性與定量檢測(cè)方法，并對(duì)其 HPLC 定量檢測(cè)方法進(jìn)行方法 學(xué)研究 ； （ 2） 研究超聲提取法在金絲桃素提取中應(yīng)用的可行性，從溶劑的種類、溶劑濃度、冷浸時(shí)間、超聲提取時(shí)間、超聲提取液固比、超聲提取次數(shù)幾個(gè)方面考察對(duì)提取物中金絲桃素純度的影響； （ 3） 篩選大孔 吸附 樹(shù)脂，研究大孔 吸附 樹(shù)脂分離金絲桃素的工藝條件 ； （ 4） 研究硅膠柱層析和 ODS 柱層析 在金絲桃素純化中的應(yīng)用； （ 5） 研究 制備高壓液相在 金絲桃素純化中的應(yīng)用； （ 6） 研究 大孔吸附樹(shù)脂 和 聚酰胺 在 金絲桃苷 純化中的應(yīng)用 。因此，對(duì)貫葉連翹中有效成分的分離純化工藝進(jìn)行 進(jìn)一步的研究是必要的。金絲桃素的多種藥理作用，使其成為當(dāng)前國(guó)際研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)課題之一。 本研究的意義和主要內(nèi)容 本文研究的 意義 貫葉連翹提取物和制劑是北美和歐洲最暢銷的植物藥之一 ， 從貫葉連翹中提取分離的金絲桃素 、 黃酮類化合物具有明顯的抗 腫瘤、抗病毒 和抗抑郁作用。研究開(kāi)發(fā)型高效液相制備色譜屬于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的制備分離，樣品量為微克級(jí)至克級(jí)，分離的樣品一般供生物活性測(cè)試、結(jié)構(gòu)鑒定以及作為標(biāo)準(zhǔn)品等。使用過(guò)的 Sephadex LH20可以反復(fù)再生使用，且柱子的洗脫過(guò)程往往就是凝膠的再生過(guò)程。 羥丙基葡聚糖凝膠 羥丙基葡聚糖凝膠是 Sephadex G25 經(jīng)羥丙基化處理后的產(chǎn)物。 凝膠過(guò)濾柱層析 凝膠過(guò)濾（ gel filtration）也稱凝膠滲透層析（ gel permeation chromatography）或分子篩過(guò)濾（ molecular sieve filtration），是利用分子篩來(lái)分離物質(zhì)的方法。非極性吸附樹(shù)脂是由偶極距很小的單體聚合制得的不帶任何功能基，孔表的疏水性較強(qiáng)，可通過(guò)與小分子內(nèi)的疏水部分的作用吸附溶液中的有機(jī)物，最適于由極性溶劑（如水）中吸附非極性物質(zhì)。目前已廣泛的應(yīng)用于廢水處理、工業(yè)脫色、醫(yī)藥工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、分析化學(xué)、臨床鑒定等領(lǐng)域，其中對(duì)于中藥有效成分的提取方面的研究和應(yīng)用逐年增加。需要指出的是微波穿透深度有限，微波提取設(shè)備必須配備攪拌器，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)提取。微波萃取罐一般由內(nèi)萃取腔、進(jìn)液口、回流口、攪拌裝置、微波加熱腔、排料裝置、微波源、微波抑制器幾個(gè)部分組成。由于微波穿透深度有限， 2450MHz 頻率的微波系統(tǒng)采用管道直徑均在 3～ 6 公分之間。目前國(guó)內(nèi)用于微波中藥提取的微波頻率大多為 2450MHz，其波長(zhǎng)為 12 公分，對(duì)水的穿透加熱深度在 2～ 3 公分之間，根據(jù)微波工 程的特征微波提取設(shè)備有兩種類型： （ 1）管道式微波提取設(shè)備 由微波源、微波作用腔、輸送管道以及兩個(gè)儲(chǔ)料罐組成。 Pan Y M等 [72]利用微波提取和索氏提取從龍眼皮中提取多酚類物質(zhì)，微波提取在 80℃， 500W、提取 30min，含量可達(dá)到 mg/g，而索氏提取 2h才達(dá)到 mg/g。龔盛昭 [71]應(yīng)用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，進(jìn)行了微波輔助萃取香附揮發(fā)油的工藝研究，得到了微波輔助萃取香附揮發(fā)油的最佳條件 :以環(huán)己烷為溶劑，微波功率 450W，萃取兩次，每次 90s，每次用液料質(zhì)量比為 6:1。 （ 6） 揮發(fā)油提取 揮發(fā)油又稱精油（ Essential Oils），是一類具有揮發(fā)性可隨水蒸汽蒸餾出來(lái)的油狀 液體，大部分具有香氣，如薄荷油、丁香油等。 （ 5） 皂苷類物質(zhì)的提取 皂苷是天然產(chǎn)物化學(xué)庫(kù)的重要組成之一，具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗真菌、殺精子、保肝活性等。人們?cè)诩棺祫?dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)也分離到了生物堿，其中某些動(dòng)物的生物堿與它們報(bào)攝取食用的植物有關(guān)，蟾蜍、蠑螈和某些魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)的生物堿是真正的動(dòng)物代謝產(chǎn)物。大多數(shù)存在于植物體中，個(gè)別存在于動(dòng)物體內(nèi)，具環(huán)狀結(jié)構(gòu)，難溶于水，與酸可形成鹽，有一定的旋光性與吸收光譜，大多有苦味，呈無(wú)色結(jié)晶狀，少數(shù)為液體。胡秀麗等 [64]研究了大黃總蒽醌的微波輔助提取、超聲提取和索氏提取方法，并利用分光光度法測(cè)定了提取液中總蒽醌的含量。仇燕 [60]采用 微波提取菜芙蓉花中的總黃酮，通過(guò)正交試驗(yàn)，分別考察了乙醇濃度、微波時(shí)間、微波功率即固液比等因素，結(jié)果采用 70%乙醇，微波時(shí)間 30s，固液比 1:50，顆粒度≤ 80 目， 360W 的功率下，得到最佳的提取效果。在此實(shí)驗(yàn)條件下微波提取蠶蛹蟲(chóng)草多糖具有提取率高、提取速度快、原料耗費(fèi)少、處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是從蠶蛹蟲(chóng)草中提取多糖的一種較好的工藝方法。 微波提取 的應(yīng)用 （ 1）多糖的提取 多糖是中藥和天然植物中含量最多的一種成分，也是研究最為廣泛的活性成分，董周永等[55]將微波技術(shù)應(yīng)用于荔枝多糖的提取，并用 RSA響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因子，得出最佳多糖的提取工藝為：微波時(shí)間 10min，微波功率 640W，水料比為 8 時(shí)，荔枝多糖的產(chǎn)率為 %,其多糖含量為 %。 （ 2） 節(jié)約時(shí)間 由于微波可以穿透式加熱，提取的時(shí)間大大節(jié)省。粉碎機(jī)將原料加工成飲片狀、顆粒狀或粉狀，加溶媒攪拌或浸泡預(yù)處理后送至微波提取設(shè)備，通常微波設(shè)備可以在極短的時(shí)間內(nèi)一次完成天然植物有效提取，微波提取后將料液分離，溶液送濃縮系統(tǒng)處理。 MAE 的原理在學(xué)術(shù)界有許多不同的描述，其最基本的理論還是以微波穿透性加熱的原理為基礎(chǔ)，即微波對(duì)物料進(jìn)行立體加熱，而 常規(guī)方法大多為平面加熱。 超聲植物藥物提取中的應(yīng)用 目前超聲波在提取方面的應(yīng)用已日益廣泛，并且在中藥提取方面已經(jīng)工業(yè)化。 同時(shí) ，超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解 。 中藥有效成分提取技術(shù) 超聲提取法 超聲提取的原理 超聲波在中草藥有效成分提取中的主要原理是 超聲 空化作用， 空化效應(yīng)分為穩(wěn)態(tài)空化和瞬態(tài)空化：穩(wěn)態(tài)空化是指在聲強(qiáng)度較低時(shí)產(chǎn)生的空化泡，其大小在其平衡尺寸附近振蕩，震蕩可以延續(xù)多個(gè)聲波周期，在振蕩過(guò)程中氣泡自身共振頻率與超聲波頻率相等時(shí)，發(fā)生聲場(chǎng)與氣泡的最大能量耦合，產(chǎn)生明顯的空化效應(yīng)；瞬態(tài)空化指聲強(qiáng)度大于 10W/cm2 時(shí)產(chǎn)生的生存周期較短的空化泡。 （ 3） 創(chuàng)傷治療（ Wound Healing） 貫葉連翹作為創(chuàng)傷治療的藥物已有很久的歷史，一項(xiàng)對(duì)人的研究證實(shí)了其在創(chuàng)傷治療方面的效力。由于貫葉連翹提取物在治療人酒精成癮上的成功，目前已經(jīng)有更多的研究項(xiàng)目正在進(jìn)行當(dāng)中 [51]。 目前 由中國(guó)農(nóng)科院蘭州畜牧獸醫(yī)研究所和農(nóng)業(yè)部新獸藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制的 金絲桃素制劑已被作為抗禽流感的藥物投放疫區(qū)， 疫區(qū) 養(yǎng)雞場(chǎng)和農(nóng)戶使用含有金絲桃素的飼料 15天后，沒(méi)有發(fā)生雞只病死及感染禽流感現(xiàn)象，而各未用藥區(qū)陸續(xù)仍有雞只感染，固證實(shí)在飼料中應(yīng)用金絲桃素能有效的預(yù)防禽流感的發(fā)生，經(jīng)金絲桃素對(duì)禽流感 H5N H9N2亞型病毒的殺滅效果試驗(yàn)表明，殺滅率高達(dá) %以上。該反應(yīng)是氧依賴性的，當(dāng)氧濃度下降時(shí)，金絲桃素的抗病毒活性急劇的下降，但在低濃度氧條件下仍然有一定的抗病毒活性，這可能是金絲桃素分子在激發(fā)態(tài)釋放出質(zhì)子，增強(qiáng)了活化氧粒子的活性。 抗 病毒 現(xiàn)有的研究表明，金絲桃素及偽金絲桃素在體內(nèi)外都有很強(qiáng)的抗病毒活性，可以抑制多種逆轉(zhuǎn)錄病毒 [46,47]，包括人體免疫缺陷病毒（ HIV）、 牛免疫缺陷病毒（ BIV）、鼠白血病病毒（ LPBM5）和高致病性的禽流感病毒（ H5N1 和 H9N2）等，以及多種包膜病毒，如乙肝病毒（ HBV）、丙肝病毒（ HCV）、Ⅰ型單純皰疹病毒（ HSV1）、流感病毒 A1（ Brazil）、鼠巨噬細(xì) 胞病毒（ MCMV）和辛德比病毒（ Sindbis virus）等。 1996 年， Linde 等金絲桃制劑治療 1575例輕、中度至重度抑郁癥患者的23 個(gè)隨機(jī)、雙盲、對(duì)照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 meta分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金絲桃制劑的效果明顯優(yōu)于安慰劑，其療效與標(biāo)準(zhǔn)抗抑郁藥馬普替林、阿米替林、丙咪嗪相當(dāng)。但是隨后的研究發(fā)現(xiàn)貫葉連翹提取物在 4~10mol/l 的濃度時(shí)抑制 MAO 活性的 27％，而金絲桃素在同樣濃度下只抑制活性的 2％ [41]， 研究證明貫葉連翹中黃酮類成分能抑制 MAO 的作用，貫葉金絲桃素抑制 5HT， DA， NA等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和 γ 氨基丁酸 （ GABA）， L谷氨酸等氨基酸類神經(jīng) 遞質(zhì)的重吸收，而金絲桃素抑制 mACHR 和 sigma 等神經(jīng)受體的作用 [42,43]。近年來(lái)的研究表明，提取物中的金絲桃素和貫葉金絲桃素可能是其抗抑郁的關(guān)鍵成分。由于金絲桃素 PDT 作用的光依賴性，使其成為 易于光照的皮膚 腫瘤的理想的有效治療方法。 由于自身產(chǎn)生單態(tài)氧使 DNA 可能被破壞 [30]。 金絲桃素是目前自然界中發(fā)現(xiàn)的最有效地光敏劑。 金絲桃素的藥理與藥效 貫葉連翹中含有多種具有生物活性的化學(xué)成份，其中以金絲桃素的藥理作用最為顯著，其他成份也有各種不同的藥理作用，單獨(dú)或協(xié)同發(fā)生作用。 （ 3） 差示脈沖極譜法 差示脈沖極譜法被用于檢測(cè)樣品中的總金絲桃素（包括金絲桃素、偽金絲桃素、原金絲桃素和原偽金絲桃素）的含量。為了進(jìn)一步消除干擾，溫普紅等 [23]采用薄層層析法 （ TLC） ，使干擾物質(zhì)與金絲桃素分離 ， 然后再用分光光度法對(duì)分離出的金絲桃素進(jìn)行測(cè)定，取得了較為滿意的結(jié)果。 定量分析 （ 1） 分光光度法 張健等 [24]采用分光光度法在 589 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定了貫葉連翹甲醇提取物中的總金絲桃素的含量。 金絲桃素的定性與定量分析 由于國(guó)際市場(chǎng)均以金絲桃素的 含量作為貫葉連翹提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此金絲桃素含量的 檢測(cè)也成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。 超臨界 CO2流體萃取法 采用超臨界 CO2流體萃取法 [20]，通過(guò)對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化得到的最優(yōu)條件：萃取壓力 27MPa、溫度 60℃，解析釜Ⅰ壓力 14MPa、溫度 64℃，解析釜Ⅱ壓力 6MPa、溫度 50℃， CO2 流量為25 kg/kg原料 在后處理方面，溫普紅等 [17]研制出了一種 ，可以有效的去除醇提物中易吸濕發(fā)粘的物質(zhì)如糖類和葉綠素等，使得成品易于保存并相對(duì)提高了金絲桃素的純度 。國(guó)內(nèi)目前提取金絲桃素通常采用醇提取法和堿液提取法，另外最近有報(bào)道采用超臨界 CO2提取法和大孔樹(shù)脂提取法等新方法。其他還有α 甲基 癸烷、α 甲基 丁烯、十一烷、β 蒎烯、α 萜烯醇、月桂烯、石竹烯、葎草烯以及十六碳和二十四碳 烷烴、二十四碳、二十六碳和二十八碳 烷醇等。目前研究表明，貫葉連翹中藤黃酚衍生物主要有貫葉金絲桃素（ Hyperforin）、加貫葉金絲桃（ Adhyperforin） ， 分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖 14[5]。植株的所有部位皆含有蘆丁，發(fā)芽期葉中的含量為 2％，高于花中含量（ ％）。 （ 2）黃酮類化合物 目前研究表明貫葉連翹中的黃酮類化合物主要有蘆丁（ Rutin）、金絲桃苷（ Hyeroside）、異槲皮苷（ Isoquercitrin）、槲皮苷（ Quercitrin）、槲皮素（ Quercetin）等，分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖 13[7,8]。 圖 12 貫葉連翹中萘駢二蒽酮類化合物分子結(jié)構(gòu)式 Molecular Structure of Naphtodianthrones in Hypericum Perforatum L. 鮮植物中還含有原金絲桃素（ Protohypericin）以及原偽金絲桃素（ Protopseudohypericin），光照后即分別轉(zhuǎn)化為金絲桃素和偽金絲桃素。 貫葉連翹的主要化學(xué)成分已被分離鑒定，一般認(rèn)為其主要成分包括：黃酮類化合物（ flavonol glycosides）、萘駢二蒽酮類化合物（ naphtodianthrones）、間苯三酚衍生物（ pholoroglucinols derivatives）、揮發(fā)油以及有機(jī)酸等其它成分 [4]。其形態(tài)見(jiàn)圖11[3]?；ㄐ?yàn)榫蹅銧罨ㄐ?，生于莖及分枝兩端。由于該日是圣經(jīng)記載中施洗者圣約翰的誕生日期，且這植物含有紅色液汁，當(dāng)時(shí)的人們認(rèn)為這是圣約翰殉道時(shí)流出的血液，為此人們認(rèn)為這種植物具有神奇的力量，因此在歐洲以及美國(guó)等地貫葉連翹通常被稱為圣約翰草 （ St. John’s Wort） [2]。在德國(guó)將其用于抗抑郁藥也有近百年的歷史。 貫葉金絲桃有效成分純化及抗腫瘤新藥研制開(kāi)發(fā) 項(xiàng)目實(shí)施技術(shù)總結(jié)報(bào)告 第一部分 金絲桃素的提取與純化 一、 總體技術(shù)路線圖 二、 二、具體實(shí)施方案和結(jié)果 第一章 緒論 金絲桃素的研究開(kāi)發(fā)進(jìn)展 金絲桃素屬于萘駢二蒽酮類化合物，主要存在于藤黃科金絲桃屬植物中，其中以貫葉連翹的應(yīng)用最為廣泛。美國(guó)醫(yī)生在十九世紀(jì)和二十世紀(jì)用其治療歇斯底里癥和因抑郁而產(chǎn)生的各種神經(jīng)癥狀。 這種植物通常在每年 6 月 24日前后開(kāi)花，花瓣呈黃色。單葉生，葉無(wú)柄，彼此靠近密集，橢圓形至線形，長(zhǎng) 1～ 2 厘米，寬 ～ 厘米，背卷，上面綠色，下面白綠色，全面散布透明或黑色的腺點(diǎn)，黑色腺點(diǎn)大多分布于葉片邊緣或近頂端。種子黑褐色，圓柱形，長(zhǎng)約 1 毫米，花期 78 月，果期 910 月。 貫葉連翹的化學(xué)成分 由于貫葉連翹具有重要的藥理作用，故其化學(xué)成分的研究也一直是熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了大量的研究。在花瓣中金絲桃素的含量最高，達(dá) ％，偽金絲桃素的含量是金絲桃素的 2～ 4 倍 [6]。 植物中還存在偽金 絲桃素的氧化產(chǎn)物環(huán)偽金絲桃素（ Cyclopseudohypericin）。葉和花中