動物生化試題-資料下載頁
2025-11-09 23:09本頁面
【正文】 蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。（1）可逆的沉淀的反應(yīng)此時蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時，常利用此類反應(yīng)。（2）不可逆沉淀反應(yīng)此時蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機酸的反應(yīng)都屬于此類。蛋白質(zhì)變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度考馬斯亮藍(lán)G250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰(max)位置由465 nm變?yōu)?95 nm，溶液顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過測定595 nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。靈敏度高，測定快速簡便，干擾物質(zhì)少。微量凱氏定氮法有機物與濃硫酸共熱，有機氮轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機氮（氨），氨與硫酸作用生成硫酸氨，后者與強堿作用釋放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此過量酸液被中和的程度，即可計算出樣品的含氮量。中和程度用滴定法來判斷，分回滴法和直接法兩種。（1）回滴法：用過量的標(biāo)準(zhǔn)酸吸收氨，其剩余的酸可用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，由鹽酸量減去滴定所耗NaOH的量即為被吸收的氨之量。此法采用甲基紅做指示劑。（2）直接法：用硼酸作為氨的吸收溶液，結(jié)果使溶液中[H+]降低，混合指示劑（－），黑紫色變?yōu)榫G色。再用標(biāo)準(zhǔn)酸來滴定，使硼酸恢復(fù)到原來的氫離子濃度為止，指示劑出來淡紫色為終點，此時所耗的鹽酸量即為氨的量。樣液：%NaCl液，并稀釋至100ml。如有不溶物，離心取上清液備用。醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)本實驗是以醋酸纖維素薄膜作為支持體的區(qū)帶電泳。方法是將少量新鮮血清用點樣器點在浸有緩沖液的乙酸纖維素薄膜上，薄膜兩端經(jīng)過濾紙與電泳槽中緩沖液相連，血清蛋白質(zhì)在此緩沖液中均帶負(fù)電荷，在電場中向正極泳動。由于血清中不同蛋白質(zhì)帶有的電荷數(shù)量及分子量不同而泳動速度不同。帶電荷多及分子量小者泳動速度快；帶電荷少及分子量大者泳動速度慢，從而彼此分離。電泳后，將薄膜取出，經(jīng)染色和漂洗，薄膜上顯示出五條藍(lán)色區(qū)帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)，按泳動快慢順序，一般經(jīng)漂洗后，薄膜上可呈現(xiàn)清晰的5條區(qū)帶，由正極端起，依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。經(jīng)洗脫比色觀察不同蛋白質(zhì)的區(qū)帶。醋酸纖維素薄膜一定要充分浸透后才能點樣。點樣后電泳槽一定要密閉。電流不宜過大，以防止薄膜干燥，電泳圖譜出現(xiàn)條痕。因為過小可使區(qū)帶拖尾，過大則使區(qū)帶過于緊密。電泳槽中緩沖液要保持清潔(數(shù)天過濾)兩極溶液要交替使用；最好將連接正、負(fù)極的線路調(diào)換使用。通電過程中，不準(zhǔn)取出或放入薄膜。通電完畢后，應(yīng)先斷開電源后再取薄膜，以免觸電。酶的特性溫度對酶活力的影響大多數(shù)動物酶的最適溫度為37－40℃，植物酶的最適溫度為50－60℃。高溫失活，低溫能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。pH對酶活性的影響。唾液淀粉酶的活化和抑制酶的活性受活化劑或抑制劑的影響。氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為其抑制劑。血糖的定量測定動物血液中的糖主要是葡萄糖，其含量較恒定。用硫酸鋅和氫氧化鈉除去被檢測血中的蛋白質(zhì)制成無蛋白血濾液。當(dāng)將血濾液與標(biāo)準(zhǔn)鐵氰化鉀溶液共熱時,一部分鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，并與鋅離子生成不溶性化合物。向混合物中加入碘化物后，用硫代硫酸鈉溶液滴定所釋放的碘。即可知剩余的鐵氰化鉀量。血糖越多，剩余的鐵氰化鉀越少，所消耗的硫代硫酸鈉也越少。硫代硫酸鈉溶液用量與血糖的關(guān)系可以由經(jīng)驗確定下來的數(shù)字表查出。對照組要多一些，且要先查表再相減脂肪酸的β－氧化樣品中丙酮的含量=(V1V2)x C Na2S2O3 x 1/6 V1—滴定對照所消耗的Na2S2O3 的體積 V2—滴定樣品所消耗的Na2S2O3 的體積 C—Na2S2O3 的濃度維生素C的定量測定2，6二氯酚靛酚滴定法用藍(lán)色的堿性染料標(biāo)準(zhǔn)溶液,對含維生素 C的酸性浸出液進行氧化還原滴定,染料被還原為無色,當(dāng)?shù)竭_(dá)滴定終點時,多余的染料在酸性介質(zhì)中則表現(xiàn)為淺紅色,如無其他干擾物質(zhì)存在，樣品提取液所還原的標(biāo)準(zhǔn)染料量與樣品中所含的還原性抗壞血酸量成正比。過氧化物酶的作用 過氧化物酶能催化過氧化氫釋出新生氧以氧化某些酚類和胺類物質(zhì)，例如氧化溶于水中的焦性沒食子酸生成不溶于水的焦性沒食子橙（橙紅色）；氧化愈創(chuàng)木脂中的愈創(chuàng)木酸成為藍(lán)色的愈創(chuàng)木酸的臭氧化物。目前測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測定方法：物理性質(zhì)：紫外分光光度法?；瘜W(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法等。染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法。其他性質(zhì)：熒光法。一、凱氏定氮法： 根據(jù)蛋白質(zhì)的含氮量來測定蛋白質(zhì)的含量公式:每g樣品中含氮克數(shù) 100二、比色法：利用蛋白質(zhì)與不同試劑的呈色反應(yīng)，測定蛋白質(zhì)的含量，如雙縮尿法和酚試劑法（lowry’s method）。三、紫外分光光度法：利用蛋白質(zhì)對280nm紫外光有最大的吸光度而采用
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