動(dòng)物生化試題-資料下載頁(yè)
2024-11-18 23:09本頁(yè)面
【正文】 蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類(lèi)。（1）可逆的沉淀的反應(yīng)此時(shí)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來(lái)的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí)，常利用此類(lèi)反應(yīng)。（2）不可逆沉淀反應(yīng)此時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來(lái)溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)都屬于此類(lèi)。蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度考馬斯亮藍(lán)G250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰(max)位置由465 nm變?yōu)?95 nm，溶液顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過(guò)測(cè)定595 nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。靈敏度高，測(cè)定快速簡(jiǎn)便，干擾物質(zhì)少。微量凱氏定氮法有機(jī)物與濃硫酸共熱，有機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)氮（氨），氨與硫酸作用生成硫酸氨，后者與強(qiáng)堿作用釋放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此過(guò)量酸液被中和的程度，即可計(jì)算出樣品的含氮量。中和程度用滴定法來(lái)判斷，分回滴法和直接法兩種。（1）回滴法：用過(guò)量的標(biāo)準(zhǔn)酸吸收氨，其剩余的酸可用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，由鹽酸量減去滴定所耗NaOH的量即為被吸收的氨之量。此法采用甲基紅做指示劑。（2）直接法：用硼酸作為氨的吸收溶液，結(jié)果使溶液中[H+]降低，混合指示劑（－），黑紫色變?yōu)榫G色。再用標(biāo)準(zhǔn)酸來(lái)滴定，使硼酸恢復(fù)到原來(lái)的氫離子濃度為止，指示劑出來(lái)淡紫色為終點(diǎn)，此時(shí)所耗的鹽酸量即為氨的量。樣液：%NaCl液，并稀釋至100ml。如有不溶物，離心取上清液備用。醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)本實(shí)驗(yàn)是以醋酸纖維素薄膜作為支持體的區(qū)帶電泳。方法是將少量新鮮血清用點(diǎn)樣器點(diǎn)在浸有緩沖液的乙酸纖維素薄膜上，薄膜兩端經(jīng)過(guò)濾紙與電泳槽中緩沖液相連，血清蛋白質(zhì)在此緩沖液中均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。由于血清中不同蛋白質(zhì)帶有的電荷數(shù)量及分子量不同而泳動(dòng)速度不同。帶電荷多及分子量小者泳動(dòng)速度快；帶電荷少及分子量大者泳動(dòng)速度慢，從而彼此分離。電泳后，將薄膜取出，經(jīng)染色和漂洗，薄膜上顯示出五條藍(lán)色區(qū)帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)，按泳動(dòng)快慢順序，一般經(jīng)漂洗后，薄膜上可呈現(xiàn)清晰的5條區(qū)帶，由正極端起，依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。經(jīng)洗脫比色觀(guān)察不同蛋白質(zhì)的區(qū)帶。醋酸纖維素薄膜一定要充分浸透后才能點(diǎn)樣。點(diǎn)樣后電泳槽一定要密閉。電流不宜過(guò)大，以防止薄膜干燥，電泳圖譜出現(xiàn)條痕。因?yàn)檫^(guò)小可使區(qū)帶拖尾，過(guò)大則使區(qū)帶過(guò)于緊密。電泳槽中緩沖液要保持清潔(數(shù)天過(guò)濾)兩極溶液要交替使用；最好將連接正、負(fù)極的線(xiàn)路調(diào)換使用。通電過(guò)程中，不準(zhǔn)取出或放入薄膜。通電完畢后，應(yīng)先斷開(kāi)電源后再取薄膜，以免觸電。酶的特性溫度對(duì)酶活力的影響大多數(shù)動(dòng)物酶的最適溫度為37－40℃，植物酶的最適溫度為50－60℃。高溫失活，低溫能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。pH對(duì)酶活性的影響。唾液淀粉酶的活化和抑制酶的活性受活化劑或抑制劑的影響。氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為其抑制劑。血糖的定量測(cè)定動(dòng)物血液中的糖主要是葡萄糖，其含量較恒定。用硫酸鋅和氫氧化鈉除去被檢測(cè)血中的蛋白質(zhì)制成無(wú)蛋白血濾液。當(dāng)將血濾液與標(biāo)準(zhǔn)鐵氰化鉀溶液共熱時(shí),一部分鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，并與鋅離子生成不溶性化合物。向混合物中加入碘化物后，用硫代硫酸鈉溶液滴定所釋放的碘。即可知剩余的鐵氰化鉀量。血糖越多，剩余的鐵氰化鉀越少，所消耗的硫代硫酸鈉也越少。硫代硫酸鈉溶液用量與血糖的關(guān)系可以由經(jīng)驗(yàn)確定下來(lái)的數(shù)字表查出。對(duì)照組要多一些，且要先查表再相減脂肪酸的β－氧化樣品中丙酮的含量=(V1V2)x C Na2S2O3 x 1/6 V1—滴定對(duì)照所消耗的Na2S2O3 的體積 V2—滴定樣品所消耗的Na2S2O3 的體積 C—Na2S2O3 的濃度維生素C的定量測(cè)定2，6二氯酚靛酚滴定法用藍(lán)色的堿性染料標(biāo)準(zhǔn)溶液,對(duì)含維生素 C的酸性浸出液進(jìn)行氧化還原滴定,染料被還原為無(wú)色,當(dāng)?shù)竭_(dá)滴定終點(diǎn)時(shí),多余的染料在酸性介質(zhì)中則表現(xiàn)為淺紅色,如無(wú)其他干擾物質(zhì)存在，樣品提取液所還原的標(biāo)準(zhǔn)染料量與樣品中所含的還原性抗壞血酸量成正比。過(guò)氧化物酶的作用 過(guò)氧化物酶能催化過(guò)氧化氫釋出新生氧以氧化某些酚類(lèi)和胺類(lèi)物質(zhì)，例如氧化溶于水中的焦性沒(méi)食子酸生成不溶于水的焦性沒(méi)食子橙（橙紅色）；氧化愈創(chuàng)木脂中的愈創(chuàng)木酸成為藍(lán)色的愈創(chuàng)木酸的臭氧化物。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法：物理性質(zhì)：紫外分光光度法。化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法等。染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法。其他性質(zhì)：熒光法。一、凱氏定氮法： 根據(jù)蛋白質(zhì)的含氮量來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量公式:每g樣品中含氮克數(shù) 100二、比色法：利用蛋白質(zhì)與不同試劑的呈色反應(yīng)，測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，如雙縮尿法和酚試劑法（lowry’s method）。三、紫外分光光度法：利用蛋白質(zhì)對(duì)280nm紫外光有最大的吸光度而采用
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