【正文】 物的基質(zhì)，即培養(yǎng)基。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮陀猛静煌?，培養(yǎng)基可分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和加富（富集）培養(yǎng)基。【按物質(zhì)的不同，培養(yǎng)基可分為合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基和符合培養(yǎng)基】1什么叫選擇培養(yǎng)基？那些培養(yǎng)基屬于選擇培養(yǎng)基？答：選擇培養(yǎng)基就是用以抑制非目的微生物的生長(zhǎng)并使所要分離的微生物生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基。麥康蓋培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基。【配制選擇培養(yǎng)基時(shí)可加入染料、膽汁鹽、金屬鹽類、酸、堿或抗生素等其中的一種】1什么叫鑒別培養(yǎng)基？哪些培養(yǎng)基屬于鑒別培養(yǎng)基？答：當(dāng)幾種細(xì)菌由于對(duì)培養(yǎng)基中某一成分的分界能力不同，其菌落通過(guò)指示劑先是除不太那個(gè)的顏色而被區(qū)分開(kāi)，這種起鑒別和區(qū)分不同細(xì)菌作用的培養(yǎng)基叫鑒別培養(yǎng)基。常用的鑒別培養(yǎng)基遠(yuǎn)滕氏培養(yǎng)基、醋酸鉛鋅培養(yǎng)基、伊紅—美藍(lán)（EMB）培養(yǎng)基等。1如何從被糞便污染的水樣中將大腸桿菌群中的四種菌逐一鑒別出來(lái)？答：大腸菌屬中的大腸埃希氏菌、枸 酸鹽桿菌、產(chǎn)氣桿菌、副大腸桿菌等均能在遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但它們對(duì)乳酸的分解能力不同：前三種能分界乳糖，但分解能力有強(qiáng)有弱，大腸埃希氏菌分解能力最強(qiáng)，菌落呈紫紅色帶金屬光澤；枸 酸鹽桿菌次之，菌落呈紫紅或深紅色；產(chǎn)氣桿菌第三，菌落呈淡紅色。副大腸桿菌不能分界乳糖，菌落無(wú)色透明。1如何判斷某水樣是否被糞便污染？1營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是如何進(jìn)入細(xì)胞的? 答：微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)各種各樣，有水溶性和脂溶性，有小分子和大分子。不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的方式也不同：?jiǎn)渭償U(kuò)散、促進(jìn)擴(kuò)散、主動(dòng)運(yùn)輸和基團(tuán)轉(zhuǎn)位。1營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)順濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞的方式有哪些？是如何進(jìn)入的？答：有單純擴(kuò)散和促進(jìn)擴(kuò)散。單純擴(kuò)散是利用細(xì)胞質(zhì)膜上的小孔，促進(jìn)擴(kuò)散是利用細(xì)胞質(zhì)膜上的特殊蛋白質(zhì)。1營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逆濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞的方式有哪些？是如何進(jìn)入的？ 答：有主動(dòng)運(yùn)輸和基團(tuán)轉(zhuǎn)位。主動(dòng)運(yùn)輸需要滲透酶（單向轉(zhuǎn)運(yùn)載體、同向轉(zhuǎn)運(yùn)載體和反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體）和能量?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)位有特定的轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，是通過(guò)單向性的磷酸化作用而實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞質(zhì)膜對(duì)大多數(shù)磷酸化的化合物有高度的不滲透性。1什么叫主動(dòng)運(yùn)輸？什么叫基團(tuán)轉(zhuǎn)位？答：主動(dòng)運(yùn)輸：當(dāng)微生物細(xì)胞內(nèi)所積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度高于細(xì)胞外的濃度時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就不能按濃度梯度擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，而是逆濃度梯度被“抽”進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，這種需要能量和滲透酶的逆濃度梯度積累營(yíng)養(yǎng)物的過(guò)程；基團(tuán)轉(zhuǎn)位：以糖為例，在細(xì)胞內(nèi)，在酶I存在下，先是HPr被磷酸烯醇丙酮酸（細(xì)胞代謝產(chǎn)物）磷酸化形成HPr—磷酸，并被一道細(xì)胞質(zhì)膜上。在膜的外側(cè)，外界供給的糖有滲透酶攜帶到細(xì)胞質(zhì)膜上，在特異性酶II的村華夏，糖被HPr—磷酸磷酸化形成糖—磷酸。滲透酶將膜上已被磷酸化的糖攜帶到細(xì)胞內(nèi)，隨即被代謝?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)位是通過(guò)單向性的磷酸化作用而實(shí)現(xiàn)的。什么叫新陳代謝？2微生物呼吸作用的本質(zhì)是什么？可分為哪幾種類型？各類型有什么特點(diǎn)？答：微生物呼吸作用的本質(zhì)是氧化與還原的統(tǒng)一過(guò)程，這過(guò)程中有能量的產(chǎn)生和能量的轉(zhuǎn)移。微生物的呼吸類型有三類：發(fā)酵、好氧呼吸和無(wú)氧呼吸。最終電子受體不同，分別為中間代謝產(chǎn)物、氧氣、氧氣外的無(wú)機(jī)化合物。另外產(chǎn)能的多少也不同。2葡萄糖在好氧條件下是如何氧化徹底的？答：在好氧呼吸過(guò)程中，葡萄糖的氧化分解分兩階段：I葡萄糖經(jīng)EMP途徑酵解。這一過(guò)程不需要消耗氧，形成中間產(chǎn)物——丙酮酸。II丙酮酸的有氧分解。丙酮酸氧化過(guò)程的一系列步驟總稱為三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）。三羧酸（TCA）循環(huán)、乙醛酸循環(huán)和電子傳遞體系。2什么加底物水平磷酸化、氧化磷酸化和光合磷酸化？答：底物水平磷酸化：厭氧微生物和兼性厭氧微生物在基質(zhì)氧化過(guò)程中，產(chǎn)生一種含高自由能的中間體，如發(fā)酵中產(chǎn)生含高能鍵的1，3二磷酸甘油酸。這一中間體將高能鍵（~）交給ADP，使ADP磷酸化而生成ATP。氧化磷酸化：好氧微生物在呼吸時(shí)，通過(guò)電子傳遞體系產(chǎn)生ATP的過(guò)程。光合磷酸化：光引起葉綠素、菌綠素或菌紫素逐出電子，通過(guò)電子傳遞產(chǎn)生ATP的過(guò)程。2何謂光合作用，比較闡揚(yáng)光合作用和不產(chǎn)氧光合作用的異同。第五篇：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)菌群體生長(zhǎng)表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計(jì)數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過(guò)濾法(membrane filtration)等。測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測(cè)定，細(xì)胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測(cè)定，代謝產(chǎn)物的測(cè)定等?？傊?，測(cè)定微生物生長(zhǎng)量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。本實(shí)驗(yàn)主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法和光電比濁計(jì)數(shù)法。一 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（一）目的要求1．明確血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理。2．掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。（二）基本原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。目前國(guó)內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、PeteroffHauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后，，因此可用油浸物鏡對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。除了用這些計(jì)菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡(jiǎn)單。但此法的缺點(diǎn)是所測(cè)得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時(shí)間）以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來(lái)達(dá)到只計(jì)數(shù)活菌體的目的。本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。另外兩種計(jì)菌器的使用方法可參看各廠商的說(shuō)明書(shū)。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖l51。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格(圖15—2)；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無(wú)論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為lmm，則每一個(gè)大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，(萬(wàn)分之一毫升)。圖15—1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造（一）圖15—2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造（二）；； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計(jì)數(shù)室；；計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/525104B=50000AB（個(gè)）同理，如果是16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，1mL菌液中的總菌數(shù)=A/516104B=32000AB（個(gè)）（三）器材1．菌種 釀酒酵母2．儀器或其他用具 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無(wú)菌毛細(xì)滴管。（四）操作步驟l．菌懸液制備以無(wú)菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?．鏡檢計(jì)數(shù)室在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。3．加樣品將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。4．顯微鏡計(jì)數(shù)加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對(duì)于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見(jiàn)豎線或只見(jiàn)橫線。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。5．清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告l．結(jié)果將結(jié)果記錄于下表中。A表示五個(gè)中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/ml12345第一室第二室2．思考題(1)根據(jù)你的體會(huì)，說(shuō)明用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來(lái)自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差．力求準(zhǔn)確?(2)某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)1～2種可行的檢測(cè)方法。二平板菌落計(jì)數(shù)法（一）目的要求學(xué)習(xí)習(xí)近平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法。（二）、基本原理平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可來(lái)自樣品中的2～3或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colonyforming units，cfu)而不以絕對(duì)菌落數(shù)來(lái)表示樣品的活菌含量。平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計(jì)數(shù)方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測(cè)。（三）器材1．菌種 大腸桿菌菌懸液。2．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。3．儀器或其他用具lm1無(wú)菌吸管，無(wú)菌平皿，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。（四）操作步驟l．編號(hào)取無(wú)菌平皿9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明1010106。(稀釋度)各3套。，依次標(biāo)是1010101010106。2．稀釋用lmL無(wú)菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測(cè)樣品)，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。OptionsEmail Replies將101試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10?1試管中來(lái)回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時(shí)不要太猛太快，吸時(shí)吸管伸人管底，吹時(shí)離開(kāi)液面，以免將吸管中的過(guò)濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取101菌液lmL，此即為100倍稀釋。……其余依次類推，整個(gè)過(guò)程如圖153所示。放菌液時(shí)吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個(gè)稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。3，取樣用三支1mL無(wú)菌吸管分別吸取10105和106。的稀釋菌懸液各lmL，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無(wú)菌平皿中。，這樣容易加大同一稀釋度幾個(gè)重復(fù)平板間的操作誤差。圖15—3平板菌落計(jì)數(shù)操作步驟4．倒平板．盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動(dòng)平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或?yàn)R到平皿蓋上。由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長(zhǎng)成的菌落連在一起，影響計(jì)數(shù)。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5．計(jì)數(shù)培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個(gè)平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)5一般選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30~300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個(gè)重復(fù)對(duì)照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗(yàn)不精確。實(shí)際工作中同一稀釋度重復(fù)對(duì)照平板不能少于三個(gè)，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，減少誤差。由1010106三個(gè)稀釋度計(jì)算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個(gè)連續(xù)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。平板菌落計(jì)數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進(jìn)行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號(hào)，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺(tái)上適當(dāng)吹干，然后用無(wú)菌吸管吸取稀釋好的菌液對(duì)號(hào)接種于不同稀釋度編號(hào)的平板上，并盡快用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。，如果過(guò)少菌液不易涂布開(kāi)，過(guò)多則在涂布完后或在培養(yǎng)時(shí)菌液仍會(huì)在平板表面流動(dòng)，不易形成單菌落。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．結(jié)果2．將培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果填入下表稀釋度104105106Cfu數(shù)/平板123平均123平均123平均每毫升中的cfu2．思考題(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?(2)要使平板菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵?為什么?(3)試比較平板菌落計(jì)數(shù)法和顯微鏡下直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)缺點(diǎn)及