【正文】 物的基質(zhì)，即培養(yǎng)基。根據(jù)實驗?zāi)康暮陀猛静煌?，培養(yǎng)基可分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和加富（富集）培養(yǎng)基?！景次镔|(zhì)的不同，培養(yǎng)基可分為合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基和符合培養(yǎng)基】1什么叫選擇培養(yǎng)基？那些培養(yǎng)基屬于選擇培養(yǎng)基？答：選擇培養(yǎng)基就是用以抑制非目的微生物的生長并使所要分離的微生物生長繁殖的培養(yǎng)基。麥康蓋培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基?！九渲七x擇培養(yǎng)基時可加入染料、膽汁鹽、金屬鹽類、酸、堿或抗生素等其中的一種】1什么叫鑒別培養(yǎng)基？哪些培養(yǎng)基屬于鑒別培養(yǎng)基？答：當幾種細菌由于對培養(yǎng)基中某一成分的分界能力不同，其菌落通過指示劑先是除不太那個的顏色而被區(qū)分開，這種起鑒別和區(qū)分不同細菌作用的培養(yǎng)基叫鑒別培養(yǎng)基。常用的鑒別培養(yǎng)基遠滕氏培養(yǎng)基、醋酸鉛鋅培養(yǎng)基、伊紅—美藍（EMB）培養(yǎng)基等。1如何從被糞便污染的水樣中將大腸桿菌群中的四種菌逐一鑒別出來？答：大腸菌屬中的大腸埃希氏菌、枸 酸鹽桿菌、產(chǎn)氣桿菌、副大腸桿菌等均能在遠藤氏培養(yǎng)基上生長，但它們對乳酸的分解能力不同：前三種能分界乳糖，但分解能力有強有弱，大腸埃希氏菌分解能力最強，菌落呈紫紅色帶金屬光澤；枸 酸鹽桿菌次之，菌落呈紫紅或深紅色；產(chǎn)氣桿菌第三，菌落呈淡紅色。副大腸桿菌不能分界乳糖，菌落無色透明。1如何判斷某水樣是否被糞便污染？1營養(yǎng)物質(zhì)是如何進入細胞的? 答：微生物的營養(yǎng)物質(zhì)各種各樣，有水溶性和脂溶性，有小分子和大分子。不同營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞的方式也不同：單純擴散、促進擴散、主動運輸和基團轉(zhuǎn)位。1營養(yǎng)物質(zhì)順濃度梯度進入細胞的方式有哪些？是如何進入的？答：有單純擴散和促進擴散。單純擴散是利用細胞質(zhì)膜上的小孔，促進擴散是利用細胞質(zhì)膜上的特殊蛋白質(zhì)。1營養(yǎng)物質(zhì)逆濃度梯度進入細胞的方式有哪些？是如何進入的？ 答：有主動運輸和基團轉(zhuǎn)位。主動運輸需要滲透酶（單向轉(zhuǎn)運載體、同向轉(zhuǎn)運載體和反向轉(zhuǎn)運載體）和能量。基團轉(zhuǎn)位有特定的轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，是通過單向性的磷酸化作用而實現(xiàn)的，細胞質(zhì)膜對大多數(shù)磷酸化的化合物有高度的不滲透性。1什么叫主動運輸？什么叫基團轉(zhuǎn)位？答：主動運輸：當微生物細胞內(nèi)所積累的營養(yǎng)物質(zhì)的濃度高于細胞外的濃度時，營養(yǎng)物質(zhì)就不能按濃度梯度擴散到細胞內(nèi)，而是逆濃度梯度被“抽”進細胞內(nèi)，這種需要能量和滲透酶的逆濃度梯度積累營養(yǎng)物的過程；基團轉(zhuǎn)位：以糖為例，在細胞內(nèi)，在酶I存在下，先是HPr被磷酸烯醇丙酮酸（細胞代謝產(chǎn)物）磷酸化形成HPr—磷酸，并被一道細胞質(zhì)膜上。在膜的外側(cè)，外界供給的糖有滲透酶攜帶到細胞質(zhì)膜上，在特異性酶II的村華夏，糖被HPr—磷酸磷酸化形成糖—磷酸。滲透酶將膜上已被磷酸化的糖攜帶到細胞內(nèi)，隨即被代謝?；鶊F轉(zhuǎn)位是通過單向性的磷酸化作用而實現(xiàn)的。什么叫新陳代謝？2微生物呼吸作用的本質(zhì)是什么？可分為哪幾種類型？各類型有什么特點？答：微生物呼吸作用的本質(zhì)是氧化與還原的統(tǒng)一過程，這過程中有能量的產(chǎn)生和能量的轉(zhuǎn)移。微生物的呼吸類型有三類：發(fā)酵、好氧呼吸和無氧呼吸。最終電子受體不同，分別為中間代謝產(chǎn)物、氧氣、氧氣外的無機化合物。另外產(chǎn)能的多少也不同。2葡萄糖在好氧條件下是如何氧化徹底的？答：在好氧呼吸過程中，葡萄糖的氧化分解分兩階段：I葡萄糖經(jīng)EMP途徑酵解。這一過程不需要消耗氧，形成中間產(chǎn)物——丙酮酸。II丙酮酸的有氧分解。丙酮酸氧化過程的一系列步驟總稱為三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）。三羧酸（TCA）循環(huán)、乙醛酸循環(huán)和電子傳遞體系。2什么加底物水平磷酸化、氧化磷酸化和光合磷酸化？答：底物水平磷酸化：厭氧微生物和兼性厭氧微生物在基質(zhì)氧化過程中，產(chǎn)生一種含高自由能的中間體，如發(fā)酵中產(chǎn)生含高能鍵的1，3二磷酸甘油酸。這一中間體將高能鍵（~）交給ADP，使ADP磷酸化而生成ATP。氧化磷酸化：好氧微生物在呼吸時，通過電子傳遞體系產(chǎn)生ATP的過程。光合磷酸化：光引起葉綠素、菌綠素或菌紫素逐出電子，通過電子傳遞產(chǎn)生ATP的過程。2何謂光合作用，比較闡揚光合作用和不產(chǎn)氧光合作用的異同。第五篇：微生物學實驗細菌群體生長表現(xiàn)為細胞數(shù)目的增加或細胞物質(zhì)的增加。測定細胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過濾法(membrane filtration)等。測定細胞物質(zhì)的方法有細胞干重的測定，細胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測定，代謝產(chǎn)物的測定等?？傊?，測定微生物生長量的方法很多，各有優(yōu)缺點，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。本實驗主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計數(shù)法、平板菌落計數(shù)法和光電比濁計數(shù)法。一 顯微鏡直接計數(shù)法（一）目的要求1．明確血細胞計數(shù)板計數(shù)的原理。2．掌握使用血細胞計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。（二）基本原理顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計菌器有：血細胞計數(shù)板、PeteroffHauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數(shù)，基本原理相同。后兩種計菌器由于蓋上蓋玻片后，，因此可用油浸物鏡對細菌等較小的細胞進行觀察和計數(shù)。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細菌學檢查。顯微鏡直接計數(shù)法的優(yōu)點是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時間）以及加細胞分裂抑制劑等方法來達到只計數(shù)活菌體的目的。本實驗以血球計數(shù)板為例進行顯微鏡直接計數(shù)。另外兩種計菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)是一種常用的微生物計數(shù)方法。該計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。血細胞計數(shù)板構(gòu)造如圖l51。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格(圖15—2)；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，(萬分之一毫升)。圖15—1 血細胞計數(shù)板構(gòu)造（一）圖15—2 血細胞計數(shù)板構(gòu)造（二）；； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計數(shù)室；；計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。設(shè)五個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個中方格的計數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/525104B=50000AB（個）同理，如果是16個中方格的計數(shù)板，1mL菌液中的總菌數(shù)=A/516104B=32000AB（個）（三）器材1．菌種 釀酒酵母2．儀器或其他用具 血細胞計數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。（四）操作步驟l．菌懸液制備以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當?shù)木鷳乙骸?．鏡檢計數(shù)室在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數(shù)。3．加樣品將清潔干燥的血細胞計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。4．顯微鏡計數(shù)加樣后靜止5min，然后將血細胞計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強弱適當，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個菌體為宜。每個計數(shù)室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算樣品的含菌量。5．清洗血細胞計數(shù)板使用完畢后，將血細胞計數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。（五）實驗報告l．結(jié)果將結(jié)果記錄于下表中。A表示五個中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/ml12345第一室第二室2．思考題(1)根據(jù)你的體會，說明用血細胞計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差．力求準確?(2)某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請設(shè)計1～2種可行的檢測方法。二平板菌落計數(shù)法（一）目的要求學習習近平板菌落計數(shù)的基本原理和方法。（二）、基本原理平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，所以，長成的一個單菌落也可來自樣品中的2～3或更多個細胞。因此平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colonyforming units，cfu)而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。平板菌落計數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時間才能取得，而且測定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計數(shù)方法的最大優(yōu)點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。（三）器材1．菌種 大腸桿菌菌懸液。2．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。3．儀器或其他用具lm1無菌吸管，無菌平皿，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。（四）操作步驟l．編號取無菌平皿9套，分別用記號筆標明1010106。(稀釋度)各3套。，依次標是1010101010106。2．稀釋用lmL無菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測樣品)，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。OptionsEmail Replies將101試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10?1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸人管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取101菌液lmL，此即為100倍稀釋?！溆嘁来晤愅?，整個過程如圖153所示。放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。3，取樣用三支1mL無菌吸管分別吸取10105和106。的稀釋菌懸液各lmL，對號放入編好號的無菌平皿中。，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復平板間的操作誤差。圖15—3平板菌落計數(shù)操作步驟4．倒平板．盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。由于細菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數(shù)。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5．計數(shù)培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進行計算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)5一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重復對照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復對照平板不能少于三個，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計，減少誤差。由1010106三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。平板菌落計數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個連續(xù)稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調(diào)整。平板菌落計數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺上適當吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。，如果過少菌液不易涂布開，過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。五、實驗報告1．結(jié)果2．將培養(yǎng)后菌落計數(shù)結(jié)果填入下表稀釋度104105106Cfu數(shù)/平板123平均123平均123平均每毫升中的cfu2．思考題(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?(2)要使平板菌落計數(shù)準確，需要掌握哪幾個關(guān)鍵?為什么?(3)試比較平板菌落計數(shù)法和顯微鏡下直接計數(shù)法的優(yōu)缺點及