【正文】 脂的斜面培養(yǎng)基），28℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)，將活化1d后的金霉素鏈霉菌種接入斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5～7天，金霉素 土霉素 四環(huán)素待孢子長(zhǎng)成灰色，于4℃冰箱中保藏。種子培養(yǎng)：在斜面上用接種鏟挑取1cm2左右生長(zhǎng)良好的菌體接入裝有50ml四環(huán)素種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，230 r/min、28℃下振蕩培養(yǎng)20～24h。發(fā)酵培養(yǎng)：以剪口移液槍頭取10 ml種子液接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)液的500ml錐形瓶中（注意：同一處理組用同一瓶種子液接種），230 r/min、28℃下振蕩培養(yǎng)5 d。用于后面的測(cè)定效價(jià)和薄層層析實(shí)驗(yàn)。四環(huán)素的提取和精制（選作）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．掌握沉淀法精制四環(huán)素的原理、方法和基本操作技術(shù)。2 ．熟悉pH 的控制與產(chǎn)量、質(zhì)最的關(guān)系。二、實(shí)驗(yàn)原理四環(huán)素為兩性化合物。當(dāng)溶液pH 等于等電點(diǎn)時(shí)，四環(huán)素呈游離堿形式，從水溶液中沉淀出來(lái)。利用四環(huán)素的這一性質(zhì)，可將四環(huán)素從發(fā)酵液中提取出來(lái)。在連續(xù)結(jié)晶過(guò)程中，pH 的高低對(duì)產(chǎn)量、質(zhì)量都有一定的影響。 , 在pH ~ 之間，游離堿在水中的溶解度乎不變。若pH 控制在接近等電點(diǎn)時(shí)，沉淀結(jié)品雖然比較完全，收率也高，但此時(shí)會(huì)有大量雜質(zhì)同時(shí)析出，影響產(chǎn)品的色澤和質(zhì)量；若pH控制得較低一些，對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量雖有好處，但沉淀結(jié)晶不夠完全，收率會(huì)低些，影響產(chǎn)量。因此，在選擇沉淀結(jié)晶pH 時(shí)，就必須同時(shí)考慮到產(chǎn)量、質(zhì)量的效果。在正常情況下。若沉淀結(jié)晶質(zhì)量較差，pH可控制得稍低些，有利于結(jié)晶質(zhì)量的改善，否則收率低，影響產(chǎn)量。四環(huán)素的提取和精制分酸化、純化、過(guò)濾、結(jié)晶和淋洗五個(gè)步驟。(1)酸化加入草酸，使積聚在菌絲體內(nèi)的四環(huán)素盡可能多地成為可溶性鹽，而轉(zhuǎn)入液相。四環(huán)素在酸性條件下較隱定，且草酸與鈣離子反應(yīng)生成不溶性的草酸鈣，析出的草酸鈣能促進(jìn)蛋白質(zhì)的凝固，提高濾液的純度和過(guò)濾速度。(2）純化 純化劑（黃血鹽、硫酸鋅和硼砂）與草酸一起混合作用，可以除去發(fā)酵液中大量酸溶性蛋白質(zhì)、鐵離子和其他多種離子色素以及其他雜質(zhì)，從而使濾液純凈，并減少發(fā)酵液的粘度，利于過(guò)濾。其中純化劑黃血鹽能與發(fā)酵液中的鐵離子作用，生成普魯士鹽而除去鐵離子。(3）過(guò)濾 通過(guò)過(guò)濾，使四環(huán)素溶液與菌絲體以及其他雜質(zhì)分離，再經(jīng)過(guò)復(fù)濾、精濾，進(jìn)一步提高濾液質(zhì)址，得到澄清的濾液。(4)結(jié)晶將濾液的pH調(diào)節(jié)到等電點(diǎn)，在較低溫度下析出純凈的四環(huán)素。(5）淋洗 雖然發(fā)酵液經(jīng)酸化后大部分四環(huán)素已溶入溶液中，但仍有部分殘存在菌渣中，且過(guò)濾不可能十分徹底。所以用酸水淋洗，以提高收率。三、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 1．試劑300 g/L草酸溶液、200 g/L 黃血酸鉀溶液、200 g/L 硫酸鋅溶液、200 g/L 硼砂溶液、濃氮水、3 g/L草酸溶液。2．儀器1000 mL 燒杯、攪拌器、布氏漏斗、抽濾瓶、濾紙、量筒、pH 試紙、酸度計(jì)、溫度計(jì)、水泵、表面皿。四、實(shí)驗(yàn)步驟 1．酸化取600ml 四環(huán)素發(fā)酵液，置裝有機(jī)械攪拌的1000 mL燒杯中，開(kāi)始攪拌，待發(fā)酵液溫度降至20 ℃ 以下時(shí)，緩緩加入草酸溶液，草酸加入量為27～35g/L，并不時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的pH。~ 時(shí)（用酸度計(jì)測(cè)定），酸化完畢。2．純化在酸化反應(yīng)的燒壞中，按酸化的發(fā)酵液凈體積，攪拌下依次緩慢加入純化劑（黃血酸鉀溶液、硫酸鋅溶液、硼砂溶液），每種溶液終濃度均為2 g/L，加入時(shí)間間隔15min，以便作用完全。3．過(guò)濾將布氏漏斗裝于抽濾瓶上，鋪好濾紙，開(kāi)啟水泵，用少量水將濾紙濕潤(rùn)，并使濾紙緊貼布氏漏斗。將純化后的溶液緩緩倒入布氏漏斗，過(guò)濾濾液應(yīng)完全澄清，否則必須重新過(guò)濾，直到完全澄清。將抽濾瓶中的濾液倒入裝有機(jī)械攪拌的1000 mL燒杯中，開(kāi)動(dòng)攪拌，并用水或冰水冷卻。待濾液溫度冷至5 ～ 7 ℃ 時(shí)，徐徐加入經(jīng)過(guò)濾的濃氨水，并隨時(shí)用pH 試紙測(cè)定溶液的pH，當(dāng)pH ～ 時(shí)（用酸度計(jì)測(cè)定），停止加入氨水，并繼續(xù)攪拌2 h，使結(jié)晶完全。裝好布氏漏斗后，將上述液緩緩倒人布氏漏斗，過(guò)濾。結(jié)晶液全部倒入后，抽干。用35～45 ℃ 的熱水充分洗滌粗堿3 次，抽干， ％草酸洗滌，抽干。五、注意事項(xiàng)1．純化攪拌時(shí)間不應(yīng)少于2h，溶液溫度保持在15 ℃ 以下。2．pH 要調(diào)準(zhǔn)確。六、結(jié)果與討論 ．計(jì)算四環(huán)素的得率。．討論影響四環(huán)素得率和純度的因素。實(shí)驗(yàn)三 四環(huán)素、金霉素的薄層層析鑒定（驗(yàn)證型）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆毡訉游龅脑?，四環(huán)素族抗生素的定性鑒定方法。實(shí)驗(yàn)原理：層析（色譜，chromatograpby）是相當(dāng)重要、且相當(dāng)常見(jiàn)的一種技術(shù)，在把微細(xì)分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動(dòng)相的系統(tǒng)中（根據(jù)移動(dòng)相種類的不同，分為液相層析和氣相層析二種），使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動(dòng)，利用各成分對(duì)固定相親和力不同所引起的移動(dòng)速度差，將它們彼此分離開(kāi)的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。用作固定相的有硅膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無(wú)活性的載體上附著適當(dāng)?shù)囊后w。將作為固定相的微細(xì)粉末狀物質(zhì)裝入細(xì)長(zhǎng)形圓筒中進(jìn)行的層析稱為柱層析（column chromatography），在玻璃板上涂上一層薄而均的支持物（硅膠、纖維素和淀粉等）作為固定相的稱為薄層層析（thin layer chromatography），或者用濾紙作為固定相的紙上層析。層析根據(jù)固定相與溶質(zhì)（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型層析等類型。但這并不是很嚴(yán)格的，有時(shí)常見(jiàn)到其中間類型。此外，近來(lái) 5 也應(yīng)用親和層析，即將與基質(zhì)類似的化合物（通常為共價(jià)鍵）結(jié)合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對(duì)應(yīng)的特定的酶或蛋白質(zhì)。分配層析在支持物上形成部分互溶的兩相系統(tǒng)。一般是水相和有機(jī)溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等親水物質(zhì)，這些物質(zhì)能儲(chǔ)留相當(dāng)量的水。被分離物質(zhì)在兩相中都能溶解，但分配系數(shù)不同，展層時(shí)就會(huì)形成以不同速度向前移動(dòng)的區(qū)帶。一種溶質(zhì)在兩種互不混溶的溶劑系統(tǒng)中分配時(shí)，在一定溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相溶劑中的濃度之比為一常數(shù)，稱為分配系數(shù)。當(dāng)欲被分離的各種物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同時(shí)，它們就能被分離開(kāi)。分配系數(shù)大的移動(dòng)快（阻力?。?。薄層層析是以薄層材料為支持物，在密閉容器中，樣品在其上展開(kāi)。當(dāng)斑點(diǎn)不易為肉眼觀察時(shí)，可利用適當(dāng)?shù)娘@色劑，或通過(guò)紫外燈下產(chǎn)生熒光的方法進(jìn)行觀察。通過(guò)這種展開(kāi)操作，各成分呈斑點(diǎn)狀移動(dòng)到各自的位置上，再根據(jù)Rf值的測(cè)定進(jìn)行鑒定。薄層色譜法具有分離與鑒定的雙重功能，通過(guò)薄層圖譜與對(duì)照品的圖譜相比較，除了能鑒出有效成分或特征成分外，還以完整的色譜圖作為一個(gè)整體對(duì)制劑加以鑒別。薄層色譜分析法由于簡(jiǎn)便、快速，能有效地、直觀地反映藥品地真實(shí)性、穩(wěn)定性，現(xiàn)已成為藥物制劑的鑒別和質(zhì)量控制的行之有效的方法之一。薄層層析是鑒別抗生素的方法之一，層析后進(jìn)行顯色，并繪制層析圖譜，根據(jù)層析圖譜對(duì)抗生素進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)以四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為對(duì)照對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行鑒定。儀器和設(shè)備：（薄層層析硅膠煙臺(tái)芝罘區(qū)黃務(wù)硅膠開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)廠有售） 試劑：四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品 ，4℃冰箱保存（可使用7天）。展開(kāi)劑：正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)2L。凡士林 實(shí)驗(yàn)步驟：1．層析板處理層析板105℃烘烤過(guò)夜，()，于空氣中晾干、備用。2．點(diǎn)樣～， ，10000 rpm，5min，備用。~3 cm起始線上(用鉛筆劃線，做出點(diǎn)樣點(diǎn)記號(hào))，用毛細(xì)玻璃管在薄層層析板上點(diǎn)四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品和金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液3次，發(fā)酵液上清點(diǎn)8～10次，每次都要吹干后再點(diǎn)。（一般效價(jià)在1000u／ml以上點(diǎn)3次，500～1000u／ml點(diǎn)4次，200～500u／ml點(diǎn)5次）。剩余的發(fā)酵液上清于4℃冰箱保存。（展開(kāi)）用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展開(kāi)劑。層析前需預(yù)先用展開(kāi)劑預(yù)平衡層析缸，可在缸中倒入2cm高的展開(kāi)劑，密閉，一般保持15－30分鐘。然后將層析板置于盛有展開(kāi)劑的層析缸中，在室溫下展層6～8h（與溫度有關(guān)）。封口不嚴(yán)可涂抹凡士林。4．熒光顯影待溶劑前沿展至板的一半以上時(shí)將層析板取出，標(biāo)出溶劑前沿，于通風(fēng)櫥中晾干，用氨水熏數(shù)秒鐘后即可在紫外燈下顯影，畫出黃色斑點(diǎn)，分別算出Rf值。（四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品慢和金霉素標(biāo)準(zhǔn)品快）無(wú)水四環(huán)素在波長(zhǎng)365nm下顯黃色熒光，根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照可定性測(cè)定。注意事項(xiàng)：因四環(huán)素能和鈣鹽形成不溶性化合物，故發(fā)酵液中的四環(huán)素濃度不高，預(yù)處理時(shí)通常用草酸將發(fā)酵液酸化至pH＝～，使四環(huán)素盡量溶解。點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。要控制好點(diǎn)樣量，樣品太少，斑點(diǎn)不清楚，難以觀察，但樣品量太多時(shí)往往出現(xiàn)斑點(diǎn)太大或拖尾現(xiàn)象。若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點(diǎn)樣，但應(yīng)待前次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點(diǎn)樣，以防樣點(diǎn)過(guò)大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，而影響分離效果。作展開(kāi)劑中極少量強(qiáng)極性溶劑(％)或pH值的改變可顯著改善拖尾現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)四 四環(huán)素的效價(jià)測(cè)定（綜合型）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私饪股匦r(jià)的表示方法學(xué)習(xí)抗生素的測(cè)定方法 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)利用比色法測(cè)定四環(huán)素和金霉素的效價(jià)。效價(jià)(titer或titre)是評(píng)價(jià)抗生素效能的標(biāo)準(zhǔn)，它代表抗生素對(duì)微生物的抗菌效力，也是衡量發(fā)酵液中抗生素含量的尺度，人們以1181。g金霉素或四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品為1個(gè)單位。四環(huán)素和金霉素在酸性條件下，加熱，可產(chǎn)生黃色的脫水金霉素和脫水四環(huán)素，其色度與含量成正比。在堿性條件下，四環(huán)素較穩(wěn)定，而金霉素則生成無(wú)色的異金霉素：根據(jù)上述原理，可以在酸性條件下，利用比色法測(cè)定四環(huán)素、金霉素混合液的總效價(jià)；而四環(huán)素效價(jià)的測(cè)定可在堿性條件下，使金霉素生成無(wú)色的異金霉素，然后再在酸性條件下，使四環(huán)素生成黃色的脫水四環(huán)素，經(jīng)比色測(cè)得四環(huán)素效價(jià)?？傂r(jià)與四環(huán)素效價(jià)二者之差即為金霉素的效價(jià)。本實(shí)驗(yàn)只測(cè)定四環(huán)素的效價(jià)。因四環(huán)素能和鈣鹽形成不溶性化合物，故發(fā)酵液中的四環(huán)素濃度不高，預(yù)處理時(shí)通常用草酸將發(fā)酵液酸化至pH＝～，使四環(huán)素盡量溶解。發(fā)酵液中，由于雜質(zhì)的干擾，將影響比色的正確性，因此加入乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)作為螯合劑，掩飾金屬離子的干擾，改變四環(huán)素脫水條件(降低酸度或延長(zhǎng)加熱時(shí)間)，可以減少雜質(zhì)對(duì)比色反應(yīng)的干擾。實(shí)驗(yàn)步驟：取上述保存的處理發(fā)酵液上清l ml(效價(jià)約為1000U／m1)于50ml容量瓶中，加入lml濃度為lg／l00ml EDTA溶液，加蒸餾水9ml，再加入lml濃度為3mol／L的NaOH，在20~25℃下保溫15min后，／L的HCl，煮沸15min后，冷卻，稀釋至刻度，在分光光度計(jì)上于440nm處測(cè)定其吸光度值。（紫外為100390nm；可見(jiàn)光為380780nm，根據(jù)波長(zhǎng)選擇石英比色池或玻璃比色池，否則玻璃對(duì)于紫外光有吸收）對(duì)照樣品（不加誘導(dǎo)劑）的前處理方法與上述步驟一樣，只是在加入HCl后，不加熱，稀釋至刻度，作為測(cè)定樣品的空白對(duì)照, 調(diào)零。四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（1000U/ml）取1ml于50ml容量瓶中，加1ml濃度為6mol／L的HCl，水浴煮沸15min后，冷卻，稀釋至50ml，380nm測(cè)吸光度。（以蒸餾水作為空白測(cè)定）以定向發(fā)酵培養(yǎng)基中的對(duì)照組作為空白對(duì)照，測(cè)定其它三個(gè)處理組的吸光度。（有時(shí)可能因?qū)φ战M處理不當(dāng)而使其它組的讀數(shù)為負(fù)值，這時(shí)可以以蒸餾水作為空白。）計(jì)算公式：發(fā)酵液中四環(huán)素的效價(jià)=A發(fā)酵 A四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)