【導(dǎo)讀】通過干預(yù)修飾進而干預(yù)代謝的小分子化合物。具體地，將就如下關(guān)鍵科學(xué)問題開。物；探索相關(guān)蛋白質(zhì)修飾酶類和底物通過何種網(wǎng)絡(luò)及分子機制進行調(diào)控。于腫瘤發(fā)生發(fā)展有何病理意義。實現(xiàn)腫瘤的預(yù)防與干預(yù)。在廣度方面主要系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)參與細。方面，我們將重點研究對組蛋白甲基化和DNA去甲基化酶的調(diào)控機理；同時，用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的策略尋找針對上述具有治療潛力的靶分子的活性小分子化合物?；⒘姿峄?、羥基化、甲基化修飾鑒定的技術(shù)方法與平臺。探討這些腫瘤發(fā)病過。基化、甲基化等蛋白底物與動態(tài)變化。特別是細胞在表觀遺傳性狀及血管新生等生理性狀受雙加氧酶活力改變的影響。的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究和開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗癌新藥重大需求方面有所突破。地，同時培養(yǎng)一批交叉學(xué)科人才。闡明5－10個因組蛋白甲基化水平或。DNA甲基化水平改變導(dǎo)致的下游基因表達改變及其病理生理效應(yīng)。胞內(nèi)活性受KG及其結(jié)構(gòu)類似代謝物濃度調(diào)控的脯銨酸羥基化酶。

　　

【正文】 集機制和修飾調(diào)控方面的后起 之秀。研究團隊成員已經(jīng)開展許多與本項目相關(guān)的研究，其中包括科技部 “973”項目、國家自然科學(xué)基金重大、重點項目和中國科學(xué)院創(chuàng)新項目，特別是具有相關(guān)國家級重大 /重點項目實施的豐富經(jīng)驗，完全能確保本項目順利實施并達到預(yù)期目標。 3. 前期工作基礎(chǔ)扎實 本項目研究團隊在蛋白質(zhì)合成、折疊、修復(fù)、降解及氧化還原修飾研究等方面，已有著非常扎實的研究基礎(chǔ)，本項目團隊成員發(fā)表的與本項目相關(guān)的通訊作者 /第一作者研究論文中，在 Cell、 Nature、 Science 及子刊上 3 篇，影響因子大 10的有5 篇，影響因子 105 之 間的有 43 篇。這些扎實的研究工作基礎(chǔ)為本項目的順利實施與取得預(yù)期成果奠定了堅實的基礎(chǔ)。 本項目也有很多前期工作基礎(chǔ)。本課題成員建立了多種有效的 “亮氨酰 tRNA 合成酶與底物氨基酸和 tRNA 相互作用 ”研究系統(tǒng)；深入研究了 EFG 和 LepA 參與的核糖體移位過程；在蛋白質(zhì)巰基亞硝基化修飾的功能和方法研究方面有堅實的基礎(chǔ)；對 PDI 和其同源蛋白的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系有二十多年系統(tǒng)的研究基礎(chǔ)；對參與釀酒酵母氧化應(yīng)激的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及相互作用關(guān)系進行了系統(tǒng)的研究，初步闡明了氧化應(yīng)激過程中電子傳遞的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)；系統(tǒng)研究了 酵母 Prion 蛋白 Ure2 的折疊、聚集以及其 GPx、 GST、 GRX 酶活性；在αSynuclein 和 TDP43 的聚集和包涵體形成機制方面取得了重要的研究成果，在雙功能輔伴侶對淀粉樣聚集蛋白的調(diào)控方面也有很好的進展；在大分子擁擠與蛋白質(zhì)聚集關(guān)系研究方面具有特色；在甲醛作為 Tau 蛋白異常磷酸化的觸發(fā)因素研究方面35 以及核糖誘導(dǎo)蛋白質(zhì)糖基化錯誤折疊等方面有系統(tǒng)的研究，提出了 “甲醛應(yīng)激 ”的新觀點。 4. 良好的工作條件和環(huán)境保障項目的順利實施 本項目依托、承擔(dān)和參加研究單位（中國科學(xué)院生物物理研究所、中國科學(xué)院上 海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所、中國科技大學(xué)、北京大學(xué)和武漢大學(xué)）都屬于國內(nèi)一流的科研院校，有很強的綜合科研實力，尤其是大部分科研骨干都依托于國家級、省部級重點實驗室，包括生物大分子國家重點實驗室、腦與認知國家重點實驗室、分子生物學(xué)國家重點實驗室、合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家實驗室（籌）、病毒學(xué)國家重點實驗室等，為本項目的開展提供了非常好的工作環(huán)境和研究條件，滿足本項目在儀器設(shè)備和技術(shù)方法的需求。 課題設(shè)置 課題 1 ： 蛋白質(zhì)生物合成的質(zhì)量控制 預(yù)期目標： 通過研究 LeuRS 對特異氨基酸及其對 應(yīng)的特異 tRNA 之間相互識別匹配的機制、鑒定依賴和非依賴 tRNA 的轉(zhuǎn)移前編校發(fā)生的位點， tRNA 的氨基酸接受臂在氨基?；钚灾行暮途幮；钚灾行闹g的動態(tài)轉(zhuǎn)位過程； tRNA 關(guān)鍵核苷酸在氨基?；磻?yīng)、編校反應(yīng)各步和蛋白質(zhì)翻譯起始階段的具體作用機理，揭示蛋白合成前質(zhì)量控制的調(diào)節(jié)機制。通過對翻譯因子（ EFG， LepA）和核糖體之間的識別以及調(diào)控的研究，闡明蛋白翻譯過程中質(zhì)量控制的調(diào)節(jié)機制。 主要研究內(nèi)容： 1. 蛋白質(zhì)合成原料的質(zhì)量控制 對蛋白質(zhì)新生肽鏈生成前的質(zhì)量控制進行全面了解。以亮氨酰 tRNA 合成酶（ LeuRS）為代表，研究不同來源的 LeuRS 之合成和編校功能的特點，闡明在蛋白質(zhì)生物合成起始階段質(zhì)量控制的機理。主要技術(shù)途徑包括：通過基因克隆構(gòu)建各種突變酶以及結(jié)構(gòu)域的突變體；用生物化學(xué)和分子生物學(xué)的方法，比較突變體與天然酶功能差異；用核磁共振、Ｘ射線晶體衍射手段在原子水平上研究酶與底物精確識別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；用化學(xué)生物學(xué)方法得到非天然氨基酸做為探針去研究體內(nèi)新生肽鏈生成過程的質(zhì)量控制。 2. 蛋白質(zhì)翻譯過程中的質(zhì)量控制 在原核和真核生物中，開展對肽酰 tRNA 移位相關(guān)的兩個因子 EFG 和 LepA 的研究， 闡明它們在蛋白質(zhì)生物合成過程中的質(zhì)量控制機理和生理學(xué)意義。主要技術(shù)途徑包括基因克隆、基因打靶、 SiRNA、構(gòu)建各種突變體和截短體，以及結(jié)構(gòu)域的突變體；用核磁共振、Ｘ射線晶體衍射手段在原子水平研究 EFG/LepA 與錯配和正常底物精確識別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；用化學(xué)生物學(xué)方法得到非天然氨基酸做為探針去研究體內(nèi)蛋白質(zhì)合成過程的質(zhì)量控制；用生理學(xué)和組織細胞學(xué)的方法，比較突變個體（細胞）與野生型個體（細胞）之間的表型差異。 3. 蛋白質(zhì)跨膜前的新因子 LepA/Guf1 使用體內(nèi)定點光交聯(lián)、化學(xué)交聯(lián)、免疫印跡、免疫共沉淀、 串聯(lián)親和標簽技術(shù)36 結(jié)合質(zhì)譜等手段考察 LepA/Guf1 和其他因子的相互作用；采用分子生物學(xué)和生物化學(xué)的方法研究 LepA/Guf1 翻譯阻滯與蛋白質(zhì)合成的關(guān)系；利用基因突變，條件敲除等實驗手段研究 LepA/Guf1 與 SRP 的系統(tǒng)效應(yīng)。 經(jīng)費比例： 18% 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、中國科學(xué)院生物物理研究所 課題負責(zé)人： 王恩多 學(xué)術(shù)骨干： 秦燕 、 周小龍、朱萍 課題 2 ： 蛋白質(zhì)氧化折疊與氧化還原修飾 預(yù)期目標： 在目前已建立的蛋白質(zhì)亞硝基化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)檢測方法 的基礎(chǔ)上，發(fā)展新的巰基氧化還原修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測方法，用于篩選蛋白質(zhì)折疊體系中的氧化還原修飾敏感的關(guān)鍵蛋白?；谝呀?jīng)建立的體內(nèi)外巰基修飾方法以及相關(guān)檢測方法，結(jié)合結(jié)構(gòu)解析和體外功能重建，獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化折疊體系、線粒體氧化折疊體系及蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系的蛋白質(zhì)巰基氧化還原修飾的生理意義及調(diào)控機制，幫助揭示蛋白質(zhì)巰基氧化還原修飾與蛋白質(zhì)折疊及相關(guān)疾病的復(fù)雜關(guān)系，篩選具有調(diào)控巰基修飾功能的小分子化合物藥物先導(dǎo)物。研究巰基修飾酶的活性機制，獲得巰基氧化還原修飾調(diào)控的分子機制，探索新發(fā)現(xiàn)的巰基修飾酶的生理功能。 主要 研究內(nèi)容： 1. 發(fā)展新的巰基氧化還原修飾檢測的蛋白質(zhì)組學(xué)方法 在已經(jīng)建立的 IBP 方法的基礎(chǔ)上發(fā)展基于 SILAC （ stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture）的定量方法來定量發(fā)生巰基修飾的蛋白質(zhì)，篩選出蛋白質(zhì)折疊體系中氧化還原修飾敏感的關(guān)鍵蛋白靶點，研究氧化應(yīng)激 /氮應(yīng)激對蛋白質(zhì)氧化折疊及蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系的調(diào)控機制。為系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)氧化折疊體系及質(zhì)量控制體系提供方法上的創(chuàng)新。 2. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化折疊與巰基修飾對酶活性的調(diào)控 研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化折疊相關(guān)蛋白質(zhì)（ Ero1α、 Ero1β、 PDI 和 Prx4 等）的相互作用網(wǎng)絡(luò)，以及這些蛋白質(zhì)的亞硝基化及谷胱甘肽化修飾的生理意義。采取分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細胞生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等多學(xué)科交叉技術(shù)手段，研究 Ero1 活力的調(diào)節(jié)、 Ero1 與 PDI 相互作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過氧化氫的有效清除和新的蛋白質(zhì)氧化折疊通路等問題。鑒定 Ero1α、 Ero1β與 Prx4 的亞硝基化修飾及谷胱甘肽化修飾位點，體內(nèi)外研究巰基修飾對酶活性的影響，在細胞水平檢測巰基修飾對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)氧化折疊過程的影響。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧 化折疊相關(guān)蛋白質(zhì)的巰基修飾的生理意義。 3. 線粒體的氧化折疊 聯(lián)合利用生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段，在原子分辨率水平上闡明線粒體膜間隙蛋白質(zhì)氧化折疊時的電子傳遞機理，完善線粒體膜間隙蛋白成熟過程中的氧化折疊體系。我們選用最經(jīng)典的真核生物研究模型釀酒酵母，解析 Mia40Erv1 和 Mia40底物蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，解析粒體膜間隙中血紅素 /銅轉(zhuǎn)運蛋白和其他具有重要生物學(xué)功能的蛋白的結(jié)構(gòu)，測量線粒體膜間隙中已知的血紅素 /銅轉(zhuǎn)運蛋白的活性，分析37 血紅素 /銅轉(zhuǎn)運蛋白與底物蛋白的復(fù)合物的之間相互作用的界面，總結(jié)共同特征 ，在原子分辨率水平上揭示 Mia40Erv1 依賴的氧化折疊體系和血紅素 /銅離子轉(zhuǎn)運體系的工作原理。 4. 蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系相關(guān)蛋白質(zhì)的巰基氧化還原修飾研究 鑒定分子伴侶、泛素化降解途徑關(guān)鍵蛋白和自噬過程相關(guān)蛋白的巰基修飾位點。體外研究分子伴侶被修飾后生化性質(zhì)及活性的改變，體內(nèi)研究巰基修飾對其功能的影響。研究泛素化降解途徑受氧化應(yīng)激 /氮應(yīng)激的調(diào)控機制以及泛素化途徑失常導(dǎo)致的錯誤折疊蛋白質(zhì)聚集與細胞效應(yīng)。研究關(guān)鍵蛋白發(fā)生巰基修飾后對自噬的調(diào)控機制，以及在氧化應(yīng)激 /氮應(yīng)激條件下，自噬過程對蛋白質(zhì)錯誤折疊蛋白 的清除機制。以 CFTR、α Synuclein 以及酵母 Prion 蛋白 Ure2 等蛋白為模型蛋白，在體內(nèi)外研究蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系相關(guān)蛋白的巰基修飾對的淀粉樣纖維化的影響。研究小分子化合物對蛋白質(zhì)質(zhì)量控制過程中關(guān)鍵蛋白巰基修飾的調(diào)控作用，篩選具有調(diào)控功能的小分子化合物藥物先導(dǎo)物。 5. 巰基修飾酶的作用機制及生理功能研究： 研究具有 GRX 活性的酵母 Prion 蛋白 Ure2 新穎的酶促反應(yīng)機制， Ure2 的 GRX活性在體內(nèi)的生理意義。研究 Ure2 的 GRX 活性的催化反應(yīng)步驟；分析 Ure2 與反應(yīng)中間體之間的相互作用，確 定相互作用殘基及電子轉(zhuǎn)移機制，從而闡明 Ure2 的 GRX活性的催化機制。在正常和應(yīng)激條件下，通過已建立的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測方法，比較Ure2 存在、缺失以及處于 Prion 狀態(tài)時，酵母細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞硝基化和谷胱甘肽化修飾情況，而闡釋 Ure2 的 GRX 活性可能的生理功能。 經(jīng)費比例： 37% 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院生物物理研究所、中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 課題負責(zé)人： Sarah Perrett 學(xué)術(shù)骨干： 王志珍、周叢照、陳暢 、 黃麗華、陳立君 課題 3 ： 蛋白質(zhì)錯誤折疊及分子伴侶的作用 預(yù)期目標： 蛋白質(zhì)錯誤折疊、淀粉樣聚集和包涵體的形成與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生緊密相關(guān)。研究蛋白質(zhì)錯誤折疊發(fā)生的內(nèi)在和外部原因，錯誤折疊蛋白質(zhì)的復(fù)性和降解的平衡調(diào)控，大分子擁擠和蛋白質(zhì)包涵體的形成及對細胞的效應(yīng)，分子伴侶對蛋白質(zhì)錯誤折疊和包涵體形成的影響及其質(zhì)量控制。通過理解細胞內(nèi)外蛋白質(zhì)錯誤折疊發(fā)生的規(guī)律機制和分子伴侶的作用，為相關(guān)疾?。ㄈ缟窠?jīng)退行性疾?。┑陌l(fā)生和病理機制以及可能的預(yù)防和治療提供重要依據(jù)。 主要研究內(nèi)容： 綜合應(yīng)用生物化學(xué)、分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和細胞生物學(xué)的先進技術(shù)方法，研究神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的錯誤折疊和包涵體的 形成，分子伴侶以及輔伴侶在蛋白質(zhì)錯誤折疊的發(fā)生和清除中的調(diào)節(jié)作用。 1. 蛋白質(zhì)錯誤折疊，淀粉樣聚集和包涵體形成 (1) 蛋白質(zhì)淀粉樣聚集和纖維化的分子機制 通過檢測蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光和應(yīng)用停流與平衡結(jié)合的技術(shù)，詳細測定一些使體內(nèi) Prion 傳播特點發(fā)生改變的 Ure2 突變體的熱力學(xué)和動力學(xué)折疊特征，將其與我們已經(jīng)得到的野生型蛋白質(zhì)的參數(shù)進行比較。還將嘗試這些突變體的結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析，38 以期獲得詳細的結(jié)構(gòu)變化信息。采用包含 polyQ 序列和小的完好折疊的 Huntingtin （ Htt）蛋白的 HEATrepeat 結(jié) 構(gòu)域的嵌合體蛋白，研究鄰近的 HEATrepeat 蛋白結(jié)構(gòu)域的存在對 polyQ 序列聚集性質(zhì)的調(diào)節(jié)，以及鄰近的 polyQ 序列對 HEATrepeat結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和折疊性質(zhì)的影響。 (2) 翻譯后修飾及大分子擁擠對蛋白質(zhì)聚集的調(diào)控 以人 Prion 和 Ataxin3 （ Atx3） 等蛋白質(zhì)為對象，結(jié)合體內(nèi)和體外研究方法，研究糖基化、磷酸化修飾，泛素化修飾和 GPI 定位修飾以及大分子擁擠對模型蛋白質(zhì)聚集的調(diào)控機制。比較在生理擁擠環(huán)境和稀溶液中，翻譯后修飾的蛋白質(zhì)與無修飾的蛋白質(zhì)的分子效應(yīng)和功能差異，檢測這些特異 性修飾以及大分子擁擠對于這些模型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、聚集和纖維化程度的影響，以及對 Prion 蛋白的蛋白酶抗性和感染性的影響。闡述翻譯后修飾及大分子擁擠對于蛋白質(zhì)病理性聚集的細胞效應(yīng)及 Prion 蛋白傳播中的作用。 (3) 蛋白質(zhì)聚集和細胞內(nèi)包涵體形成 我們的前期研究表明α Synuclein/Synphilin1 （α Syn/Sph1） 間的相互作用對細胞內(nèi)包涵體（ Inclusion Bodies）形成有顯著的影響。將用 NMR、熒光及其它生化方法體外篩選和設(shè)計能夠阻止α Syn/Sph1 兩者相互作用以 及α Syn 聚集和包涵體形成的小分子化合物；并在細胞模型中驗證這些化合物對α Syn 聚集和包涵體形成以及細胞毒性的影響。 TDP43 蛋白（ TAR DNA Binding Protein of 43 kDa）的沉積與肌萎縮側(cè)索硬化癥的發(fā)生相關(guān)。我們將研究 TDP43 蛋白聚集的內(nèi)在序列因素，細胞內(nèi)形成包涵體的原因和對細胞的效應(yīng)和功能喪失。主要探索一些因素包括遺傳突變、錯誤的細胞定位、生化修飾、降解片段和 RNA 結(jié)合等對 TDP43 功能喪失和細胞毒性的影響。 2. 分子伴侶和輔伴侶對蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的作用 (1) 分子伴侶對 Prion 蛋白、 Tau 蛋白錯誤折疊和聚集的作用 以人 Prion 蛋白及其病理突變體，過磷酸化修飾的 Tau蛋白及其病理突變體為研究對象，用各種生化和細胞技術(shù)研究分子伴侶 Hsp70A1A（ Hsp70家族成員）和 ERp57（ PDI 家族成員）對這兩個蛋白質(zhì)病理性錯誤折疊的調(diào)控機制。闡釋分子伴侶在疾病發(fā)生機制中的作用，進而運用分子生物學(xué)方法設(shè)計出能夠抑制病理性錯誤折疊的分子伴侶。 (2) 分子伴侶對 Prion 傳播及 polyQ 蛋白聚集的調(diào)控 結(jié)