【正文】 及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（研究流程見附圖 2）。 二、采用遺傳與代謝組的方法系統(tǒng)研究與代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)的修飾的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其對代謝組的作用。 Mann等人利用這種技術(shù)鑒定了 59個精氨酸甲基化位點。在 Mann等人發(fā)展了一種重甲基 SILAC技術(shù)中，細胞代謝使 [13CD3] 蛋氨酸轉(zhuǎn)化為細胞唯一的甲基供體 [13CD3]SAM(S腺苷甲硫氨酸 )，從而使標記的樣品中的所有甲基化肽段與沒有標記的樣品中的甲基化肽段有了一定的質(zhì)量差別。 11 蛋白質(zhì)甲基化主要修飾精氨酸、賴氨酸殘基，但也修飾谷氨酸、組氨酸、天冬氨酸等其它殘基。將 Ti(IV)IMAC富集技術(shù)、 RPRPLC多維分離技術(shù)和磷酸肽鑒定的數(shù)據(jù)處理技術(shù)與平臺結(jié)合起來，可以組成一個具有鑒定上萬個磷酸化位點的 蛋白質(zhì)組磷酸化規(guī)?；治龅钠脚_。為了能夠規(guī)?；治觯€需要對復(fù)雜組學(xué)樣品進行有效分級。 蛋白質(zhì)組磷酸化的分析需要包括磷酸化肽段提取技術(shù)、磷酸肽的鑒定技術(shù)等多種技術(shù)的整合。利用該方法分析蛋白質(zhì)組乙酰化，可以鑒定上千個賴氨酸乙?；鞍踪|(zhì)。蛋白質(zhì)組樣品經(jīng)過分級后，每個組分分別用蛋白質(zhì)酶切。 蛋 白質(zhì)組乙酰化分析的關(guān)鍵是如何有效富集乙?；亩?。平臺將固相標記與多維分析結(jié)合，有利于定量的自動化實現(xiàn)蛋白質(zhì)組的通量化分析，可 以在30個小時（包括標記時間）定量分析 1000多個蛋白質(zhì)。 10 溶液標記是廣泛使用的標準標記方法，該策略需要許多人為操作步驟，如樣品除鹽，添加標記試劑，孵化反應(yīng)，終止反應(yīng)，樣品混合，除鹽等，這些都會影響樣品的回收率和分析的重復(fù)性，而且費時費力，容易出錯。 針對課題組成員已經(jīng)發(fā)展了蛋白質(zhì)磷酸化、甲基化、乙?；葯z測技術(shù)，以及對于蛋白質(zhì)組羥基化修飾的分析還缺乏成熟手段的現(xiàn)狀，在本課題中我們采用方法學(xué)研究與應(yīng)用研究并重的研究策略。并在此基礎(chǔ)上，明確與代謝調(diào)控的及與代謝中間物相關(guān)的下游蛋白質(zhì)靶標，進而通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法尋找可以調(diào)控這些靶標蛋白的藥物先導(dǎo)化合物。 9 三、研究方案 本項目將以已知的與代謝密切相關(guān)的肝癌、胃腸腫瘤以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等癌癥為模型，開展研究。申請 8－ 15項與本項目成果直接相 關(guān)的發(fā)明專利，并有 1－ 2項實現(xiàn)初步轉(zhuǎn)化。 5. 取得具有國際影響的原創(chuàng)性成果并力爭實現(xiàn)轉(zhuǎn)化突破 8 在國際重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表高水平論文 50 篇以上。基于具有生理或臨床意義的候選的修飾酶 ,結(jié)合修飾酶的結(jié)構(gòu)特點，發(fā)現(xiàn)或合成能干預(yù)其活性的小分子化合物，就其藥理效應(yīng)開展在細胞甚至整體水平的深入研究并優(yōu)化其結(jié)構(gòu)與功效。闡明 5－ 10個羥基化修飾的底物蛋白在謝物濃度改變時導(dǎo)致的信號通路改變及生理病理效應(yīng)。系統(tǒng)尋找細胞內(nèi)活性受 KG及其結(jié)構(gòu)類似代謝物濃度調(diào)控的脯銨酸羥基化酶。重點明確包括延胡索酸（ fumarate）、琥珀酸（ Succinate）、蘋果酸（ malate）以及 2－ hydroxylglutarate等 KG結(jié)構(gòu)類似代謝物對于組蛋白甲基化水平和 DNA甲基化水平的調(diào)控機理。尋找抑制 Warburg effect進而抑制腫瘤生長的方法。 2. 明確翻譯后修飾對代謝物的調(diào)控系統(tǒng) 系統(tǒng)研究代謝酶翻譯后修飾改變對細胞代謝物的調(diào)控作用。闡明乙?；负腿ヒ阴；笇τ诟鱾€代謝中間物的調(diào)控后果。 五年目標 1. 初步建立乙酰化調(diào)控代謝酶的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng) 系統(tǒng)鑒定參與各個代謝酶乙?；男揎椕?，主要研究糖酵解通路和 三羧酸循環(huán)通路中各個代謝酶的乙酰化修飾酶。 通過本課題的實施使我國在代 謝與腫瘤發(fā)生研究的相關(guān)領(lǐng)域保持來之不易的國際領(lǐng)先地位；力爭使我國在該方向的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究和開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗癌新藥重大需求方面有所突破。 4. 篩選針對蛋 白質(zhì)修飾酶的活性小分子化合物及其作用機制 針對組學(xué)和機理研究所發(fā)現(xiàn)的具有重要價值的蛋白質(zhì)修飾酶類（包括乙酰化酶、去乙?；?、雙加氧酶、羥基化酶及甲基化酶等） , 采用基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)原理的小分子干預(yù)物質(zhì)的計算、模擬，從天然產(chǎn)物篩選或者人工直接合成出能干預(yù)蛋白質(zhì)修飾酶類活性的小分子化合物 , 通過對發(fā)現(xiàn)的活性小分子化合物進行生化、生理功能進行驗證，然后根據(jù)結(jié)晶學(xué)手段解析蛋白修飾酶與小分子化合物形成復(fù)合體的三維晶體結(jié)構(gòu)，根據(jù)小分子化合物與蛋白修飾酶結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元素特點，對可能成藥的小分子進行優(yōu)化及藥理效應(yīng)研究。 3. 腫 瘤發(fā)生發(fā)展過程中一些代謝產(chǎn)物作用的信號通路及對腫瘤發(fā)生發(fā)展的意義 系統(tǒng)地研究與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的糖酵解通路與三羧酸循環(huán)通路相關(guān)代謝中產(chǎn)物在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機理。探討這些腫瘤發(fā)病過程中代謝酶的乙酰化、磷酸化修飾的動態(tài)變化，以及被代謝中間物調(diào)控的下游羥基化、甲基化等蛋白底物與動態(tài)變化。在深度方面主要研究各種翻譯后修飾調(diào)節(jié)代謝的分子機理，重點研究乙?；? 修飾參與代謝調(diào)控的機制；在代謝物調(diào)控下游翻譯后修飾和信號通路的分子機理方面，我們將重點研究對組蛋白甲基化和 DNA去甲基化酶的調(diào)控機理；同時，用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的策略尋找針對上述具有治療潛力的靶分子的活性小分子化合物。 主要研究內(nèi)容 我們將以項目組成員前期在代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究為基礎(chǔ)，從廣度與深 度上擴展對代謝失調(diào)引發(fā)腫瘤機理的研究。 2. 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，代謝相關(guān)翻譯后修飾如何變化，以及這些變化對于腫瘤發(fā)生發(fā)展有何病理意義。1 項目名稱： 代謝相關(guān)蛋白質(zhì)修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機制 首席科學(xué)家： 趙世民 復(fù)旦大學(xué) 起止年限： 依托部門： 教育部 上海市科委 2 一、關(guān)鍵科學(xué)問題及研究內(nèi)容 關(guān)鍵科學(xué)問題 本課題將以代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾為切入點，系統(tǒng)挖掘參與代謝酶修飾調(diào)控的乙?；土姿峄刃揎椕讣捌湫揎椀孜铮到y(tǒng)挖掘被代謝物調(diào)控的下游被甲基化和羥基化等修飾的蛋白；在此基礎(chǔ)上研究其對細胞代謝的作用，作用的分子機理以及在腫瘤發(fā)生中的變化規(guī)律和生理病理意義；并通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)方 法尋找通過干預(yù)修飾進而干預(yù)代謝的小分子化合物。具體地，將就如下關(guān)鍵科學(xué)問題開展研究： 1. 發(fā)展相關(guān)技術(shù)和研究體系，系統(tǒng)地挖掘代謝相關(guān)翻譯后修飾的修飾酶及其底物；探索相關(guān)蛋白質(zhì)修飾酶類和底物通過何種網(wǎng)絡(luò)及分子機制進行調(diào)控。 3. 研究能否通過活性小分子化合物干預(yù)代謝相關(guān)翻譯后修飾，進而干預(yù)代謝來實現(xiàn)腫瘤的預(yù)防與干預(yù)。在廣度方面主要系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)參與細胞代謝調(diào)控的翻譯后修飾的修飾酶，以及被代謝物調(diào)控的下游底物蛋白和信號通路。 1. 代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)的修飾譜及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的變化規(guī)律 以肝癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等癌癥 為模型，建立全細胞的與代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)乙?；⒘姿峄?、羥基化、甲基化修飾鑒定的技術(shù)方法與平臺。 的對應(yīng)關(guān)系與調(diào)控機制 通過代謝組學(xué)、遺傳學(xué)以及生物化學(xué)策略，比較腫瘤細胞與正常細胞中的代謝物組成特點，重點探討代謝相關(guān)修飾改變與代謝組改變的內(nèi)在聯(lián)系；建立能反應(yīng)腫瘤特征的代謝組譜，力爭發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性代謝標志物（群）。重點研究 KG）及其結(jié)構(gòu)類似的等代謝中間物影響各種 KG依賴的系列雙加氧酶功能的分子生化機理及其對細胞信號通路的影響，包括 KG對 PHD、系列組蛋白去甲基化酶以及 DNA4 去甲基化酶活力的影響以及相關(guān)雙加氧酶活力被抑制／激活后細胞的生理變化，特別是細胞在表觀遺傳性狀及血管新生等生理性狀受雙加氧酶活力改變的影響。 5 二、預(yù)期目標 總體目標 從代謝相關(guān)蛋白質(zhì)修飾的發(fā)生、調(diào)節(jié)和動態(tài)相互作用機制及其生理病理意義這一核心科學(xué)問題出發(fā) ,構(gòu)建高通量蛋白組學(xué)方法、系統(tǒng)地挖掘與代謝密切相關(guān)的蛋白質(zhì)乙酰、磷酸化、羥基化及甲基化修飾酶類及其靶蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)內(nèi)涵；用遺傳和生物化學(xué)方法鑒定一批新的蛋白質(zhì)乙酰化修飾酶類 , 用代謝組學(xué)方法比較乙?；揎椕割愒谏砑安±項l件下蛋白組水平的變化及因此引起的代謝酶乙酰化修飾變化和細胞代謝組變化；建立全細胞水平的蛋白質(zhì)羥基化修飾靶蛋白數(shù)據(jù)庫 并確定一些關(guān)鍵羥基化蛋白質(zhì) 的動態(tài)調(diào)控機制 , 并研究它們的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；以機理研究為根據(jù)，通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法系統(tǒng)研究蛋白修飾酶 HAT、 SIRT和雙加氧酶的結(jié)構(gòu)，以及修飾酶與代謝中間物和修飾酶底物組成的復(fù)合體的分子結(jié)構(gòu)，利用結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合生物化學(xué)，生物物理學(xué)及細胞生物學(xué)的方法，通過改變相關(guān)蛋白質(zhì)以及它的整個復(fù)合體在此的作用位點的結(jié)構(gòu)來驗證其生物學(xué)功能，為治療修飾酶相關(guān)疾病提供小分子藥物設(shè)計和優(yōu)化的結(jié)構(gòu)模板，為修飾酶相關(guān)的癌癥等疾病的治療提供新的途徑 , 確定并優(yōu)化可以調(diào)節(jié)代謝酶乙酰化活性的小分子藥物先導(dǎo)化合物。最后 ,以本項目的實施為契機 , 促進國內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、生物化與分子生物學(xué)、 結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及生物信息學(xué)的銜接和交叉集成 , 使參與課題的年輕骨干成6 員成為國內(nèi)相關(guān)研究的領(lǐng)軍人才，使參與單位成為國內(nèi)開展代謝與腫瘤研究的基地，同時培養(yǎng)一批交叉學(xué)科人才。闡明乙?；负腿ヒ阴；笇τ诟鱾€代謝酶生化性質(zhì)的調(diào)控機理。明確乙?；揎椗c已知磷酸化等修飾之間對代謝調(diào)控的相互關(guān)系。用代謝組學(xué)方法研究單個及多個代謝酶翻譯后修飾改變對細胞代謝物及代謝流（ metabolic flux）的影響，重點研究如何通過調(diào)節(jié)代謝酶的乙?；秸{(diào)節(jié)糖酵解通路與三羧酸循環(huán)通路的相對代謝流。 3. 建立代謝物影響表觀遺傳及信號通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 明確細胞內(nèi) KG及其結(jié)構(gòu)類似代謝物濃度對于組蛋白甲基化水平和 DNA甲基7 化水平的調(diào)控機理。闡明 5－ 10個因組蛋白甲基化水平或DNA甲基化水平改變導(dǎo)致的下游基因表達改變及其病理生理效應(yīng)。建立蛋白質(zhì)羥基化的蛋白組學(xué)分析方法，用蛋白修飾組學(xué)方法鑒定全細胞水平羥基化修飾的蛋白質(zhì)底物。 4. 解析 3－ 5個代謝相關(guān)蛋白修飾調(diào)控酶的晶體結(jié)構(gòu)，設(shè)計并優(yōu)化5－ 10個可以調(diào)節(jié)代謝或抑制代謝相關(guān)腫瘤發(fā)生信號通路的藥物先導(dǎo)小分子化合物 根據(jù)乙?；揎椪{(diào)控酶對于調(diào)控代謝酶活力及代謝中間物的重要性以及根據(jù)雙 加氧酶對于調(diào)控下游基因的重要性，有 選擇性的解析 3－ 5個代謝酶相關(guān)的乙酰化修飾酶的晶體結(jié)構(gòu)。爭取對每一種候選的修飾酶發(fā)現(xiàn) 3 種以上的先導(dǎo)小分子化合物。其中 ,在影響因子大于 10 的刊物發(fā)表 10 篇以上，在代謝與腫瘤研究取得國際領(lǐng)先地位。 6. 培養(yǎng)一批國內(nèi)從事代謝調(diào)控及蛋白質(zhì)修飾研究的交叉學(xué)科人才，使其中部分人才具有一定國際知名度。 學(xué)術(shù)思路 圍繞代謝相關(guān)蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控腫瘤發(fā)生這個核心主題，我們將聚焦代謝調(diào)控機制與代謝物和代謝下游信號通路這三個關(guān)鍵因素，解析如下主要科學(xué)問題：1，腫瘤細胞中與代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的作用與調(diào)控機制； 2，腫瘤過程中與蛋白質(zhì)修飾調(diào)控相關(guān)的代謝中 間物產(chǎn)生的特點與機制； 3，腫瘤過程中與蛋白質(zhì)修飾調(diào)控相關(guān)的代謝中間物對腫瘤相關(guān)信號通路的影響。 技術(shù)途徑 一、采用方法學(xué)研究與應(yīng)用研究并重的研究策略，研究代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。具體技術(shù)途徑包括： 1. 利用固相標記定量技術(shù)進行蛋白組學(xué)分析。我們將使用我們發(fā)展的基于兩相柱的固相標記定量多維分析的平臺開展相關(guān)蛋白組學(xué)研究。 2. 利用抗體親和富集技術(shù)開展蛋白質(zhì)組乙酰化組分析。我們制備的抗體可以高特異性的將乙酰化肽段富集出來。然后利用抗體將賴氨酸殘基乙酰化的肽段富集出來，接著利用液相色譜質(zhì)譜連用分析富集的肽段，最后利用數(shù)據(jù)庫檢索和數(shù)據(jù)處理實現(xiàn)乙?；鞍踪|(zhì)與其修飾位點的鑒定。 3. 采用固定親和技術(shù)進行蛋白質(zhì)組磷酸化分析。我們發(fā)展了一種具有 自主知識產(chǎn)權(quán)的基于鈦離子的固定親和色譜（ Ti(IV)IMAC）的磷酸肽富集技術(shù)，比常規(guī)富集技術(shù)能鑒定更多的磷酸肽；在磷酸肽鑒定的數(shù)據(jù)處理方面，發(fā)展了一種結(jié)合二級和三譜高可信鑒定磷酸肽的方法，開發(fā)了一個磷酸化蛋白質(zhì)組分析專用的軟件。我們因此發(fā)展了一種具有高正交性質(zhì)的反相色譜 (RPRPLC)技術(shù)用于磷酸肽的多維分離。 4．完善并采用重甲基 SILAC技術(shù)進行蛋白質(zhì)組的甲基化分析。由于在多個殘基上都可以被修飾、有的殘基如賴氨酸還能被多達三個甲基修飾，所以在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中鑒定甲基化肽段，需要在數(shù)據(jù)庫檢索中設(shè)臵很多可變修飾，這使檢索空間急劇擴大，導(dǎo)致甲基化修飾的肽段很難被可信的鑒定出來。當標記的樣品與不標記的樣品混合時，在質(zhì)譜中成對出現(xiàn)的峰就是甲基化的肽段，從而將其與大量的非修飾肽區(qū)分出來。最近我們改進了這一方法，直接利用合成的 [13CD3]SAM進行代謝標記，可以使鑒定的甲基化蛋白質(zhì)超過 100個。 1. 采用自上而下式的思路研究蛋白乙酰 化過程失調(diào)對相關(guān)蛋白功能、代謝調(diào)控通路、代謝產(chǎn)物及整體生化網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)影響。 2. 通過構(gòu)建過表達去乙酰化酶基因的正常及腫瘤細胞模型，并結(jié)合施以去乙酰化酶抑制劑處理；采用 LC/LCMS/MS和雙向電泳蛋白質(zhì)組技術(shù)系統(tǒng)分析胞質(zhì)蛋白質(zhì)及乙?；鞍踪|(zhì)表達情況，同時用國際上兩大代謝組學(xué)流派所采用的核磁共振技術(shù)和色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析胞質(zhì)代謝物譜；創(chuàng)新性地建立“Printing Assay”分析方法，對同一狀態(tài)下生命體的蛋白質(zhì)組、乙?；鞍踪|(zhì)組及代謝組 數(shù)據(jù)，利用計算生物學(xué)方法進行計算整合，結(jié)合 KEGG等代謝途徑的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，篩選與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，一體化地分析蛋白乙?；揎棇毎x的調(diào)控作用；發(fā)現(xiàn)與