【正文】 闡釋分子伴侶在疾病發(fā)生機(jī)制中的作用，進(jìn)而運(yùn)用分子生物學(xué)方法設(shè)計(jì)出能夠抑制病理性錯(cuò)誤折疊的分子伴侶。主要探索一些因素包括遺傳突變、錯(cuò)誤的細(xì)胞定位、生化修飾、降解片段和 RNA 結(jié)合等對(duì) TDP43 功能喪失和細(xì)胞毒性的影響。 TDP43 蛋白（ TAR DNA Binding Protein of 43 kDa）的沉積與肌萎縮側(cè)索硬化癥的發(fā)生相關(guān)。 (3) 蛋白質(zhì)聚集和細(xì)胞內(nèi)包涵體形成 我們的前期研究表明α Synuclein/Synphilin1 （α Syn/Sph1） 間的相互作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)包涵體（ Inclusion Bodies）形成有顯著的影響。比較在生理擁擠環(huán)境和稀溶液中，翻譯后修飾的蛋白質(zhì)與無修飾的蛋白質(zhì)的分子效應(yīng)和功能差異，檢測這些特異 性修飾以及大分子擁擠對(duì)于這些模型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、聚集和纖維化程度的影響，以及對(duì) Prion 蛋白的蛋白酶抗性和感染性的影響。采用包含 polyQ 序列和小的完好折疊的 Huntingtin （ Htt）蛋白的 HEATrepeat 結(jié) 構(gòu)域的嵌合體蛋白，研究鄰近的 HEATrepeat 蛋白結(jié)構(gòu)域的存在對(duì) polyQ 序列聚集性質(zhì)的調(diào)節(jié)，以及鄰近的 polyQ 序列對(duì) HEATrepeat結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和折疊性質(zhì)的影響。 1. 蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，淀粉樣聚集和包涵體形成 (1) 蛋白質(zhì)淀粉樣聚集和纖維化的分子機(jī)制 通過檢測蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光和應(yīng)用停流與平衡結(jié)合的技術(shù)，詳細(xì)測定一些使體內(nèi) Prion 傳播特點(diǎn)發(fā)生改變的 Ure2 突變體的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)折疊特征，將其與我們已經(jīng)得到的野生型蛋白質(zhì)的參數(shù)進(jìn)行比較。通過理解細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊發(fā)生的規(guī)律機(jī)制和分子伴侶的作用，為相關(guān)疾?。ㄈ缟窠?jīng)退行性疾?。┑陌l(fā)生和病理機(jī)制以及可能的預(yù)防和治療提供重要依據(jù)。 經(jīng)費(fèi)比例： 37% 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院生物物理研究所、中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： Sarah Perrett 學(xué)術(shù)骨干： 王志珍、周叢照、陳暢 、 黃麗華、陳立君 課題 3 ： 蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊及分子伴侶的作用 預(yù)期目標(biāo)： 蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、淀粉樣聚集和包涵體的形成與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生緊密相關(guān)。研究 Ure2 的 GRX 活性的催化反應(yīng)步驟；分析 Ure2 與反應(yīng)中間體之間的相互作用，確 定相互作用殘基及電子轉(zhuǎn)移機(jī)制，從而闡明 Ure2 的 GRX活性的催化機(jī)制。研究小分子化合物對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制過程中關(guān)鍵蛋白巰基修飾的調(diào)控作用，篩選具有調(diào)控功能的小分子化合物藥物先導(dǎo)物。研究關(guān)鍵蛋白發(fā)生巰基修飾后對(duì)自噬的調(diào)控機(jī)制，以及在氧化應(yīng)激 /氮應(yīng)激條件下，自噬過程對(duì)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊蛋白 的清除機(jī)制。體外研究分子伴侶被修飾后生化性質(zhì)及活性的改變，體內(nèi)研究巰基修飾對(duì)其功能的影響。我們選用最經(jīng)典的真核生物研究模型釀酒酵母，解析 Mia40Erv1 和 Mia40底物蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，解析粒體膜間隙中血紅素 /銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和其他具有重要生物學(xué)功能的蛋白的結(jié)構(gòu)，測量線粒體膜間隙中已知的血紅素 /銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，分析37 血紅素 /銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與底物蛋白的復(fù)合物的之間相互作用的界面，總結(jié)共同特征 ，在原子分辨率水平上揭示 Mia40Erv1 依賴的氧化折疊體系和血紅素 /銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體系的工作原理。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧 化折疊相關(guān)蛋白質(zhì)的巰基修飾的生理意義。采取分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等多學(xué)科交叉技術(shù)手段，研究 Ero1 活力的調(diào)節(jié)、 Ero1 與 PDI 相互作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過氧化氫的有效清除和新的蛋白質(zhì)氧化折疊通路等問題。為系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)氧化折疊體系及質(zhì)量控制體系提供方法上的創(chuàng)新。研究巰基修飾酶的活性機(jī)制，獲得巰基氧化還原修飾調(diào)控的分子機(jī)制，探索新發(fā)現(xiàn)的巰基修飾酶的生理功能。 經(jīng)費(fèi)比例： 18% 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、中國科學(xué)院生物物理研究所 課題負(fù)責(zé)人： 王恩多 學(xué)術(shù)骨干： 秦燕 、 周小龍、朱萍 課題 2 ： 蛋白質(zhì)氧化折疊與氧化還原修飾 預(yù)期目標(biāo)： 在目前已建立的蛋白質(zhì)亞硝基化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)檢測方法 的基礎(chǔ)上，發(fā)展新的巰基氧化還原修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測方法，用于篩選蛋白質(zhì)折疊體系中的氧化還原修飾敏感的關(guān)鍵蛋白。主要技術(shù)途徑包括基因克隆、基因打靶、 SiRNA、構(gòu)建各種突變體和截短體，以及結(jié)構(gòu)域的突變體；用核磁共振、Ｘ射線晶體衍射手段在原子水平研究 EFG/LepA 與錯(cuò)配和正常底物精確識(shí)別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；用化學(xué)生物學(xué)方法得到非天然氨基酸做為探針去研究體內(nèi)蛋白質(zhì)合成過程的質(zhì)量控制；用生理學(xué)和組織細(xì)胞學(xué)的方法，比較突變個(gè)體（細(xì)胞）與野生型個(gè)體（細(xì)胞）之間的表型差異。主要技術(shù)途徑包括：通過基因克隆構(gòu)建各種突變酶以及結(jié)構(gòu)域的突變體；用生物化學(xué)和分子生物學(xué)的方法，比較突變體與天然酶功能差異；用核磁共振、Ｘ射線晶體衍射手段在原子水平上研究酶與底物精確識(shí)別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；用化學(xué)生物學(xué)方法得到非天然氨基酸做為探針去研究體內(nèi)新生肽鏈生成過程的質(zhì)量控制。 主要研究內(nèi)容： 1. 蛋白質(zhì)合成原料的質(zhì)量控制 對(duì)蛋白質(zhì)新生肽鏈生成前的質(zhì)量控制進(jìn)行全面了解。 課題設(shè)置 課題 1 ： 蛋白質(zhì)生物合成的質(zhì)量控制 預(yù)期目標(biāo)： 通過研究 LeuRS 對(duì)特異氨基酸及其對(duì) 應(yīng)的特異 tRNA 之間相互識(shí)別匹配的機(jī)制、鑒定依賴和非依賴 tRNA 的轉(zhuǎn)移前編校發(fā)生的位點(diǎn)， tRNA 的氨基酸接受臂在氨基?；钚灾行暮途幮；钚灾行闹g的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)位過程； tRNA 關(guān)鍵核苷酸在氨基酰化反應(yīng)、編校反應(yīng)各步和蛋白質(zhì)翻譯起始階段的具體作用機(jī)理，揭示蛋白合成前質(zhì)量控制的調(diào)節(jié)機(jī)制。本課題成員建立了多種有效的 “亮氨酰 tRNA 合成酶與底物氨基酸和 tRNA 相互作用 ”研究系統(tǒng)；深入研究了 EFG 和 LepA 參與的核糖體移位過程；在蛋白質(zhì)巰基亞硝基化修飾的功能和方法研究方面有堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；對(duì) PDI 和其同源蛋白的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系有二十多年系統(tǒng)的研究基礎(chǔ)；對(duì)參與釀酒酵母氧化應(yīng)激的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及相互作用關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，初步闡明了氧化應(yīng)激過程中電子傳遞的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)；系統(tǒng)研究了 酵母 Prion 蛋白 Ure2 的折疊、聚集以及其 GPx、 GST、 GRX 酶活性；在αSynuclein 和 TDP43 的聚集和包涵體形成機(jī)制方面取得了重要的研究成果，在雙功能輔伴侶對(duì)淀粉樣聚集蛋白的調(diào)控方面也有很好的進(jìn)展；在大分子擁擠與蛋白質(zhì)聚集關(guān)系研究方面具有特色；在甲醛作為 Tau 蛋白異常磷酸化的觸發(fā)因素研究方面35 以及核糖誘導(dǎo)蛋白質(zhì)糖基化錯(cuò)誤折疊等方面有系統(tǒng)的研究，提出了 “甲醛應(yīng)激 ”的新觀點(diǎn)。這些扎實(shí)的研究工作基礎(chǔ)為本項(xiàng)目的順利實(shí)施與取得預(yù)期成果奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。研究團(tuán)隊(duì)成員已經(jīng)開展許多與本項(xiàng)目相關(guān)的研究，其中包括科技部 “973”項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金重大、重點(diǎn)項(xiàng)目和中國科學(xué)院創(chuàng)新項(xiàng)目，特別是具有相關(guān)國家級(jí)重大 /重點(diǎn)項(xiàng)目實(shí)施的豐富經(jīng)驗(yàn)，完全能確保本項(xiàng)目順利實(shí)施并達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。從技術(shù)途徑方面，各課題均有成熟的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制相關(guān)研究模型和方法，應(yīng)用生物化學(xué)、生物物理學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、細(xì)胞 生物學(xué)及其它現(xiàn)代生物學(xué)等技術(shù)保證項(xiàng)目預(yù)期目標(biāo)的完成。 可行性分析 1. 本項(xiàng)目的研究方案切實(shí)可行 從學(xué)術(shù)思路方面，本項(xiàng)目提出的主要科學(xué)問題和研究目標(biāo)不僅都具有理論和實(shí)際依據(jù)，而且都是該領(lǐng)域前沿性和關(guān)鍵性的問題。 4. 注重基礎(chǔ)與臨床及技術(shù)應(yīng)用相結(jié)合 本項(xiàng)目將蛋白質(zhì)質(zhì)量控制失衡的觸發(fā)因素與蛋白質(zhì)異常修飾和錯(cuò)誤折疊及認(rèn)知功能 損傷緊密結(jié)合，開發(fā)試用于老年性癡呆癥臨床診斷的生物標(biāo)記物，具有重要實(shí)際意義。由于蛋白質(zhì)質(zhì)量控制關(guān)鍵蛋白活性位點(diǎn)或調(diào)控中心多為氧化還原敏感的半胱氨酸巰基， 氧化還原修飾在質(zhì)量控制體系中的作用日益引起關(guān)注。本項(xiàng)目在此基礎(chǔ)上注重學(xué)科交叉，吸納新的研究力量，加強(qiáng)了活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的研究、應(yīng)激條件下蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的調(diào)控機(jī)制研究以及關(guān)鍵蛋白質(zhì)功能與結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究，全方位多角度揭示蛋白質(zhì)質(zhì)量控制機(jī)制和動(dòng)態(tài)變化，保證了研究成果的可靠性和先進(jìn)性。具體創(chuàng)新點(diǎn)與特色表現(xiàn)在： 1. 思路創(chuàng)新，注重系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)研究， 1+12 從關(guān)注蛋白質(zhì)質(zhì)量控制單個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能研究轉(zhuǎn)為注重功能相關(guān)蛋白質(zhì)相互 作 用 網(wǎng) 絡(luò) 研 究， 如 ： 在氧 化 折 疊 系統(tǒng) 作 用 的 研究 中 ， 將（ Ero1PDI，H2O2Prx4/Gpx7/Gpx8PDI, QSOX1）作為一個(gè)整體研究，不僅回答單一氧化折疊酶的作用機(jī)制，還將闡述氧化折疊過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原平衡調(diào)控的機(jī)制；在分子伴侶（ Hsp70、 Hsp90、 Hsp10 GroEL、 TriC）和輔伴侶（ CHIP、 HSJ USP1 BAG6）作用的系統(tǒng)研究中，除了鑒定單個(gè)分子伴侶的作用，還將闡述這些分子伴侶之間的關(guān)系，從而獲得更接近生理?xiàng)l件下的作用機(jī)制。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾，即非酶促氨基修飾（甲醛、核糖等），研究修飾后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能；建立“醛應(yīng)激”細(xì)胞模型，包括甲醛、核糖（多羥基醛）等，建立神經(jīng) Tau、α Synuclein 過度磷酸化的細(xì)胞模型，研究過度磷酸化及其相關(guān)激酶、磷酸化酶，蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系的作用等；建立“甲醛應(yīng)激”動(dòng)物模型，研究甲醛誘導(dǎo)腦內(nèi)神經(jīng) Tau 的過度磷酸 化，細(xì)胞功能變化、突觸損傷，在此基礎(chǔ)上闡明蛋白質(zhì)異常修飾與認(rèn)知功能損傷的關(guān)系；同時(shí)采用老年性癡呆癥轉(zhuǎn)基因鼠加以驗(yàn)證；內(nèi)源性甲醛等與認(rèn)知功能障礙之間的關(guān)系；開展臨床老年性癡呆癥病人內(nèi)源性甲醛的測定與認(rèn)知功能損傷的測評(píng)等，研究內(nèi)源性甲醛與老年性癡呆癥認(rèn)知功能障礙之間關(guān)系。主要包括體外聚集研究，揭示體外聚集和纖維化的物理化學(xué)規(guī)律；細(xì)胞內(nèi)包涵體研究，揭示細(xì)胞內(nèi)包涵體形成的動(dòng)態(tài)過程；分子伴侶的作用，借助體外和細(xì)胞模型研究分子伴侶和輔伴侶對(duì)蛋白質(zhì)聚集和包涵體的作用，深入研究分子伴侶相互作用及纖維的形態(tài)和形成規(guī)律的結(jié) 構(gòu)基礎(chǔ)。關(guān)注分子伴侶在蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的發(fā)生和清除中的作用。 31 課題 2 研究技術(shù)途徑示意圖 課題 3 蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊及分子伴侶的作用 首先選定與神經(jīng)退行性疾病相 關(guān)的幾個(gè)淀粉樣蛋白質(zhì)作為研究模型。之后，具體研究各個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的巰基氧化還原修飾對(duì)于蛋白質(zhì)氧化折疊與質(zhì)量控制的調(diào)控機(jī)制。最后利用分子生物學(xué)和生物化學(xué)的方法研究：蛋白質(zhì)跨膜前的新因子 LepA/Guf1 與其他因子的相互作用；LepA/Guf1翻譯阻滯與蛋白質(zhì)合成的關(guān)系； LepA/Guf1 與 SRP 的系統(tǒng)效應(yīng)。項(xiàng)目研究技術(shù)途徑示意圖如下： 項(xiàng)目總體研究技術(shù)途徑示意圖 30 課題 1 蛋白質(zhì)生物合成的質(zhì) 量控制 首先以亮氨酰 tRNA 合成酶（ LeuRS）為代表，研究不同來源的 LeuRS 之合成和編校功能的特點(diǎn)，闡明在蛋白質(zhì)生物合成起始階段質(zhì)量控制的機(jī)理。應(yīng)用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物物理學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)等分析蛋白質(zhì)質(zhì)量控制相互作用的分子網(wǎng)絡(luò)，揭示其與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在關(guān)系，獲得蛋白質(zhì)質(zhì)量控制分子機(jī)制的全景網(wǎng)絡(luò)。 29 三、研究方案 學(xué)術(shù)思路 本項(xiàng)目聚焦蛋白質(zhì)質(zhì)量控制研究領(lǐng)域前沿，結(jié)合最新發(fā)現(xiàn)和國際發(fā)展趨勢，緊扣蛋白 質(zhì)合成、折疊、修復(fù)、降解及修飾等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)的 “生老病死 ”。 4．發(fā)表論文 5080 篇，其中在國際一流期刊（ IF10）發(fā)表論文 510 篇、在國際有影響力期刊發(fā)表論文 2030篇。 3．闡明 “醛應(yīng)激 ”的分子細(xì)胞機(jī)制，以及內(nèi)源性甲醛與老年性癡呆癥認(rèn)知功能障礙之間的相關(guān)性，提供臨床基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 建立和發(fā)展研究蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和修飾調(diào)控的新技術(shù)新方法，為蛋白質(zhì)質(zhì)量控制機(jī)制研究的長期可持續(xù)發(fā)展和立足國際前沿奠定重要基礎(chǔ)，促進(jìn)蛋白質(zhì)基地建設(shè)。通過優(yōu)勢集成團(tuán)隊(duì)的通力合作，確保項(xiàng)目研究高質(zhì)量實(shí)施，著重建立較完善的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制研究體系、取得相關(guān)前沿研究突破、 揭示關(guān)鍵蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)規(guī)律與功能機(jī)制、闡析蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系的作用機(jī)制和調(diào)控機(jī)制、篩選影響蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的小分子化合物、獲得具有國際領(lǐng)先和擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的研究成果，促進(jìn)闡明重要生命活動(dòng)的基本規(guī)律和向生物醫(yī)學(xué)的轉(zhuǎn)化應(yīng)用，為蛋白質(zhì)科學(xué)領(lǐng)域的研究理論增添新內(nèi)容，為神經(jīng)退行性疾病等蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊相關(guān)疾病的預(yù)防、診治、藥物開發(fā)等研究提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)顯著提升我國蛋白質(zhì)質(zhì)量控制研究的水平和影響力，使我國在該領(lǐng)域的研究躋身于國際前列。闡明異常修飾（過度磷酸化、非酶促糖基化等）與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊之間的關(guān)系， 醛應(yīng)激導(dǎo)致的蛋白質(zhì)異常修飾與認(rèn)知障礙之間的關(guān)系；在此基礎(chǔ)上，研究內(nèi)源性甲醛作為生物標(biāo)記物用于老年性癡呆癥臨床診斷的可能性。系統(tǒng)研究分子伴侶（ Hsp70、 Hsp90、 Hsp10 GroEL、 TriC、ERp57）和輔伴侶（ CHIP、 HSJ USP1 BAG6）在蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的發(fā)生和清 除中的調(diào)節(jié)作用。篩選對(duì)氧化折疊和質(zhì)量控制具有調(diào)控功能的小分子化合物。 3． 蛋白質(zhì)巰基的氧化還原修飾對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系的影響 27 發(fā)展新 的巰基氧化還原修飾檢測的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法；研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化折疊相關(guān)蛋白質(zhì)（ Ero1和 Prx4等）的亞硝基化及谷胱甘肽化修飾的生理意義。采取分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等多種 學(xué)交叉技術(shù)手段，研究 Ero1活力的調(diào)節(jié)、 Ero1與 PDI相互作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過氧化氫的有效清除機(jī)制和