【導(dǎo)讀】呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代謝物。鹽酸水解動(dòng)物組織及水。產(chǎn)品中蛋白結(jié)合的代謝物，同時(shí)加入2-硝基苯甲醛，37℃過(guò)夜衍生化。加入氫氧化鈉，調(diào)節(jié)PH值至，再加入正己烷去除蛋白。后用乙酸乙酯提取，式檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。在添加濃度~2μg/kg范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)法回收率為。%~%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于%。酮、3-氨基-2-惡唑酮。、氨基脲和1-氨基-. 乙內(nèi)酰胺方法檢出限為。

　　

【正文】 細(xì)化工研究所 乙醇 分析純 濟(jì)南三恩化工有限公司 乙 酸乙酯 HPLC Grade B＆ J Brand 公司 正己烷 HPLC Grade B＆ J Brand 公司 四氯化碳 優(yōu)級(jí)純 天津科密歐化學(xué)試劑公司 二甲亞砜 GC Grade SigmaAldich 氯化鈉 分析純 齊魯石化公司研究院試劑 廠 氫氧化鈉 分析純 天津化學(xué)試劑三廠 2硝基苯甲醛 HPLC Grade Fluka 公司 鹽酸 分析純 淄博化學(xué)試劑廠 無(wú)水硫酸鈉 分析純 上海光華科技有限公司 水 MΩ 山東檢疫技術(shù)中心 主要溶液的配制 實(shí)驗(yàn)所用到的主要溶 液的配制如下 ： 第二章 實(shí)驗(yàn)方法 19 表 23 主要溶液及其配制方法 溶液名稱及濃度 配制方法 鹽酸溶液 (1mol/L) 移取 45mL 鹽酸于 500mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度 鹽酸溶液（ ） 移取 125mL， 1mol/L 鹽酸溶液于 1000mL容量瓶中，加水稀釋至刻度 2硝基苯甲醛溶液（ ） 稱取 100177。 10mL三角瓶中，加入 二甲亞砜，混勻 30%氯化鈉溶液 稱取氯化鈉 300177。 氯化鈉于 1000mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度 液 態(tài)混合凈化試劑 移取 5mL 正己烷與 5mL 容量瓶中混勻 甲酸溶液（ %） 移取甲酸 1mL 于 1000mL 容量瓶中，加水至刻度，混勻 甲酸溶液（ %） 移取甲酸 2mL 于 1000mL 容量瓶中，加水至刻度，混勻 甲醇 水（ 50+50）溶液 甲醇與水等量混合，搖勻 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)溶液 （ 1） 實(shí)驗(yàn)所用到的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)如下： 表 24 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度及其生產(chǎn)廠家 名稱 純度 生產(chǎn)廠家 AMOZ %～ ％ SigmaAldrich 公司 SEM %～ ％ SigmaAldrich 公司 AOZ %～ ％ SigmaAldrich 公司 AHD %～ ％ SigmaAldrich 公司 AMOZD5 ％～ % Witega 公司 SCA13C15N2 ％～ % Witega 公司 AOZD4 ％～ % Witega 公司 AHD13C3 ％～ % Witega 公司 第二章 實(shí)驗(yàn)方法 20 （ 2）實(shí)驗(yàn)所用到的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制如下： 表 25 標(biāo)準(zhǔn)溶液及其配制方法 溶液名稱及濃度 配制方法 標(biāo)準(zhǔn)貯備液（ 1mg/mL） 分別精確稱取 50mgAOZ、 AMOZ、 SEM、AHD 至 50mL 容量瓶中，用甲醇在超聲波水浴中溶解，然后甲醇定容到刻度，混合均勻 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（ 10μg/mL） 移取 AOZ、 AMOZ、 SEM、 AHD 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各 500181。L 至 50mL 容量瓶，甲醇定容，混勻 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（ 100ng/mL） 準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 100181。L 于 10mL容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，混勻 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（ 1mg/mL） 分 別 精 確 稱 取 ，SCA13C15N2， AOZD4， AHD13C3 至 50mL容量瓶中，用甲醇在超聲波水浴中溶解，然后甲醇定容到刻度，混合均勻 混合內(nèi)標(biāo)中間液（ 10μg/mL） 移取 AMOZD5， SCA13C15N2， AOZD4，AHD13C3 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各 500181。L 至 50mL容量瓶，甲醇定容，混勻 混合內(nèi)標(biāo)工作液（ 100ng/mL） 準(zhǔn)確移取混合內(nèi)標(biāo)中間液 100181。L 于 10mL容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，混勻 實(shí)驗(yàn)方法 試樣制備與保存 從所取原始樣品中取出部分有代表性樣品，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)搗碎，用四分法縮分出不少于 500g 試樣，裝入清潔容器內(nèi)，加封后作出標(biāo)記，樣品于 20℃保存。 分析步驟 洗樣 稱取 177。 試樣，置于 50mL 離心管中，用甲醇－水溶液 15mL2 洗滌，每次完畢后 4000r/min 離心 3min，棄上清；然后再用乙醇 20mL2 洗滌，每次完畢后 4000r/min 離心 3min，棄上清；最后用乙酸乙酯 15mL2 洗滌，每次完畢后4000r/min 離心 3min，棄上清。 第二章 實(shí)驗(yàn)方法 21 該步操作適用于測(cè)定結(jié)合態(tài)的硝基呋喃代謝物，如需測(cè)定代謝物總量，可省去該步驟。 水解 于離 心殘留物中加 50181。L混合內(nèi)標(biāo)工作液，再 加入 及 （ ）， 8000r/min勻漿約 2min。勻漿液在 37℃水浴中振蕩 16h（過(guò)夜），頻率為 60Hz。而后用 1mol/LNaOH或 HCl調(diào) pH至 ~，15℃ 4500r/min離心 15min，用 125mm濾紙過(guò)濾上清液。 提取和凈化 （ 1）乙酸乙酯提取 將過(guò)濾后上清液轉(zhuǎn)移至 250mL 分液漏斗中，加入 20mL 乙酸乙脂振蕩提取，靜置分層，收集上層乙酸乙酯溶液，重復(fù)操作兩次 ，合并兩次乙酸乙酯提取液，加入 15mL30%NaCl 溶液振蕩，靜置分層，棄去下層 NaCl 溶液，重復(fù)操作兩次，合并乙酸乙脂提取液于棕色雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮?dú)饬鞔蹈桑芗尤?%甲酸溶液和 液態(tài)混合凈化試劑渦旋混勻 ，轉(zhuǎn)移至 15mL離心管中， 6000r/min 離心 5min，棄去下層液，再加入 液態(tài)混合凈化試劑重復(fù)操作，取上層溶液過(guò) ，供液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。 （ 2）乙酸乙酯提取及 EN SPE 柱凈化（適用于高度渾濁濾液，如蝦、肝、蚌等樣品） 將 過(guò)濾后上清液加入到 LiChrolut EN 柱中，（預(yù)先用 3mL 乙酸乙酯、 3mL甲醇和 5mL 水進(jìn)行活化），用 3mL 水洗滌，壓干，直至其吸附劑的顏色由棕色變?yōu)槌壬?，?3mL 乙酸乙酯洗脫分析物，洗脫液經(jīng)氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?1mL 流動(dòng)相溶解，過(guò) ，供液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。 儀器參數(shù)與設(shè)定 （ 1）液相色譜條件 a) 色譜柱： Intersil ODS3,5μm,150mm()或相當(dāng)者； b) 柱溫： 20℃ ； 第二章 實(shí)驗(yàn)方法 22 c) 流動(dòng)相： A：乙腈； B： %甲酸溶液 d) 流動(dòng)相及洗 脫條件如表所示： 表 26 流動(dòng)相及梯度洗脫條件 時(shí)間（ min） 流動(dòng)相 A(乙腈 ) 流動(dòng)相 B（ %甲酸） 10% 90% 95% 5% 95% 10% 10% 5% 90% 90% e) 流速 ： ； f) 進(jìn)樣量： 20181。L； （ 2）質(zhì)譜條件 a) 離子源：電噴霧離子源； b) 掃描方式：正離子掃描； c) 檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)； d) 電噴霧電壓： 5500V； e) 霧化氣壓力： ； f) 氣簾氣壓力： ； g) 輔助氣壓力： ； h) 離子源溫度： 500℃ ； 液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定 制備濃度系列分別為 、 、 18ng/mL的硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別相當(dāng)于測(cè)試樣品含有 、 、 6181。g/kg目標(biāo)化合物。按照上述分析條件繪制目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品溶液中目標(biāo)化合物響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測(cè)定線性范圍內(nèi)。測(cè)試樣品按以下順序進(jìn)樣：試劑空白、陰性控制樣（樣品空白）、第二章 實(shí)驗(yàn)方法 23 要確證的樣品、陰性控制樣品（樣品空白）再進(jìn)樣，最后是陽(yáng)性控制樣品（質(zhì)控樣品或添加 回收樣品）。 定性方法 （ 1） 在同一天同一批次測(cè)試中，其定性離子對(duì)的提取離子流的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液或添加回收樣品的相應(yīng)離子對(duì)提取離子流的保留時(shí)間之差在 （ RT Window＝ 30s），其中 AHD RT Window＝ 5s； （ 2）測(cè)試樣品的提取離子流其信噪比 ≥3（ S/N≥3）； （ 3）在同一測(cè)定批次中，測(cè)試樣品的提取離子流應(yīng)當(dāng)與外標(biāo)相應(yīng)的提取離子流相似，其定量離子對(duì)和非定量離子對(duì)的豐度比與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定量離子對(duì)和非定量離子對(duì)的豐度比數(shù)值偏差 ≤25％。 定量方法 以 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比為縱坐標(biāo)，工作溶液濃度（ μg/kg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量。 對(duì)于常規(guī)檢測(cè)樣品，也可使用外標(biāo)單點(diǎn)法定量。 第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 24 第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 結(jié)果計(jì)算 內(nèi)標(biāo)法定量，按 下 式 計(jì)算： 10001000i s is i i sC C A A VX C A A W? ? ? ???? ? ? 式中： X —— 試樣中待測(cè)組分殘留量， 181。g/㎏； C—— 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃 度， ng/mL； Csi —— 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中 內(nèi)標(biāo)物 的濃度， ng/mL； Ci —— 樣液中 內(nèi)標(biāo)物 的濃度， ng/mL； As —— 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積； A —— 樣液中 待測(cè)目標(biāo)物 的峰面積； Asi —— 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積 ； Ai —— 樣液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積； V —— 樣品定容體積， mL； W—— 樣品稱樣量， g； 注：計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白值。 總離子流圖和保留時(shí)間 在上述方法中色譜條件和質(zhì)譜條件下，目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖見(jiàn)圖31，其參考保留時(shí)間見(jiàn)表 31。 第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 25 圖 31 硝 基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖 (AMOZ:。SEM:。AHD:。AOZ:) 表 31 硝基呋喃代謝物及內(nèi)標(biāo)參考保留時(shí)間 藥物名稱 保留時(shí)間 /min AMOZ AMOZD5 SEM SCA13C15N2 AHD AHD13C3 AOZ AOZD4 樣品衍生條件的優(yōu)化 四種硝基呋喃代謝物的分子量在 102~201之間，在這個(gè)質(zhì)量范圍內(nèi)質(zhì)譜背景噪音很大，四種代謝物的電離效率又比較低。同時(shí)， 這些代謝物無(wú)特異性裂解行為 (主要是去氨、水或二氧化碳 )，因此，它們的質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度較低。用 2硝基苯甲醛 (2NBA)衍生四種代謝物，可以分別形成具有較好特性的衍生物，質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度有很大提高。另外，禽肉中硝基呋喃的代謝物以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在于機(jī)體組織中，只有在適當(dāng)酸性條件下，通過(guò)水解才能釋放出來(lái)。因此，本方法采用鹽酸水解硝基呋喃代謝物與蛋白結(jié)合物，用 2NBA衍生四種代謝物，二第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 26 個(gè)步驟同步進(jìn)行，見(jiàn)圖 32 圖 32 結(jié)合態(tài)硝基呋喃代謝物的同步水解和衍生化 凈化條件的選擇 本文實(shí)驗(yàn)了兩種樣品凈化 方式，一是衍生化反應(yīng)溶液，調(diào) pH后用乙酸乙酯提取兩次，合并乙酸乙酯層氮?dú)獯蹈啥ㄈ?。這種方法有時(shí)出現(xiàn)乙酸乙酯和水相分層不徹底的情況，易產(chǎn)生干擾，從而影響回收率。另外是采用固相萃取柱凈化，實(shí)驗(yàn)了 Oasis Max(60mg,3ml Waters) ， Oasis HLB(60mg,3ml Waters) ，C18(500mg,3ml,)和 LiChrolut EN(200mg,3ml,Merck)四種固相萃取柱的凈化效果和回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， LiChrolut EN柱凈化效果和回收率比另外三種固相萃取柱 都較理想。本文選用 LiChrolut EN萃取柱做為凈化柱。 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 采用 ESI正離子電離模式，通過(guò)掃描確定 4種組分的母離子 MS2及確定子離子，再采用自動(dòng)和手動(dòng)優(yōu)化相結(jié)合的方式對(duì)每種硝基呋喃類代謝物及內(nèi)標(biāo)物子離子進(jìn)行 CE、 DP、 EP、 CXP的化合物條件及 IE、 CUR、 NEB、 TEM、 GAS2等離子源條件的優(yōu)化，兼顧各成分的靈敏度的不同而對(duì)離子源條件有所偏重，建立了質(zhì)譜條件，見(jiàn)表 32，和 4種硝基呋喃代謝物及各自內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的監(jiān)測(cè)離子圖譜，見(jiàn)圖 33， 34， 35， 36。 第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 27 表 32 硝基呋喃代謝物的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量和去簇電壓 名稱 定性離子對(duì) /（ m/z） 定量離子對(duì) /（ m/z） 碰撞氣能量 /eV 去簇電壓 /V SEM AHD 18 17 32 60 60 60 AOZ AMOZ SCA13C15N2 AHD13C3 AOZD4 AMOZD5 圖 33 呋喃妥因添加水平為 第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 28 圖 34 呋喃它酮添加水 平為 圖 35 呋喃唑酮添加水平為 第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 29 圖 36 呋喃西林添加水平為 檢測(cè)限、測(cè)定低限、 回收率和精密度 回收率統(tǒng)計(jì) 硝基呋喃類代謝物的回收率如下： 第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 30 表 33 呋喃妥因回收率 方法名稱 動(dòng)物源食品中硝基呋喃