【導(dǎo)讀】福建省發(fā)展與改革委員會(huì)“五新項(xiàng)目”。項(xiàng)目可行性研究報(bào)告

　　

【正文】 12 直接導(dǎo)入技術(shù)的原理、方法和技術(shù)特點(diǎn)，用外源 DNA 導(dǎo)入瓠瓜后，后代性狀的變異篩選出了抗枯萎病的材料．程備久等通過 30 keV 不同劑量的 Ar +注入和 DNA 溶液浸滴法，將比克氏棉和紅麻 DNA導(dǎo)入泗棉 2 號(hào)，結(jié)果表明： Ar +離子注入可顯著地促進(jìn)外源 DNA 導(dǎo)入受體，增加受體后代性狀的變異頻率和變異類型，而且多數(shù)變異可迅速趨于穩(wěn)定．在供試 劑量中，以 21015 Ar +為最佳 [72]．利用外源 DNA 導(dǎo)入結(jié)合病圃連續(xù)定向篩選獲得的棉花新品系 9556 95481，經(jīng)大面積重病地試驗(yàn)，不僅表現(xiàn)有良好的抗（耐）棉花枯萎病，尚兼有豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)性的特性，進(jìn)而驗(yàn)證了該技術(shù)用于棉花抗枯萎病育種的可行性 [73]． 轉(zhuǎn)基因技術(shù) 菜豆幾丁質(zhì)酶對(duì) 尖孢鐮刀菌 具有抑制作用，能影響其致病力．用花粉管通道法將菜豆幾丁質(zhì)酶基因與煙草 β1,3 葡聚糖酶基因雙價(jià)植物表達(dá)載體 pBLGC 導(dǎo)入新疆棉花主栽品種（系） 550、 82 130石遠(yuǎn) 321，通過卡那霉素 檢測(cè)、 PCRSouthern 驗(yàn)證和抗黃萎病、枯萎病篩選，得到抗病性良好且遺傳性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因棉花 [74]． 凝集素分析 寄主棉花凝集素可以與尖孢鐮刀菌結(jié)合，影響其致病力．蔡馬等 [75]用 pH ， mol/L TrisHCL緩沖液從高抗枯萎病棉花品種 861 種子脫脂粉中抽提出棉花凝集素，測(cè)定其專一性結(jié)合糖，結(jié)果表明棉花凝集素的專一性結(jié)合糖是 D半乳糖、 N乙酰 D氨基葡萄糖、 D葡萄糖；棉花凝集素提取的最適 pH 為 6～ 8，具有較高的抗熱性．用 FITC 或 HRP 標(biāo)記的棉花凝集素與枯萎 病菌絲體作用后，在熒光顯微鏡下或掃描電鏡下可以清晰地看到 FITC凝集素或 HRP凝集素 受體復(fù)合物在尖孢鐮刀菌菌絲體上均勻分布 [76,77]．曾仲奎等發(fā)現(xiàn)純化的棉花凝集素對(duì)棉花枯萎病菌絲體的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用 [78]．劉士莊等通過幾丁質(zhì)柱層析和 Sephadex G75 過濾后， SDSPAGE 電泳結(jié)果顯示一條蛋白帶，得到能專性地結(jié)合甘露糖和葡萄糖、能凝集兔血紅細(xì)胞的棉花凝集素，其分子量為 KDa．寄主凝集素的含量測(cè)定，可以對(duì)其抗尖孢鐮刀菌等級(jí)進(jìn)行分類 [79]． 4．枯萎病的防治 生 物防治 1 真菌類生防菌 用于枯萎病生物防治的真菌中，研究應(yīng)用較多的有木霉屬真菌（ Trichoderma）、叢技菌根真菌（ Arbuscular mycorrhize， AM）等 [80]．木霉分布廣泛，極易分離和培養(yǎng)，可以在許多培養(yǎng)基質(zhì)上迅速生長(zhǎng)，對(duì)多種病原菌有抑制作用，是一種理想的生防菌 [81]．木霉的生防機(jī)制目前認(rèn)為主要有重寄生、抗生和競(jìng)爭(zhēng)作用 [82]． AM 菌根是自然界普遍存在的一類真菌與植物根系建立的互惠共生體，它可促進(jìn)共生植物的生長(zhǎng)，增強(qiáng)植株的抗逆性，應(yīng)用 AM 真菌防治枯萎病是利用它與鐮刀菌存 在的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系．已報(bào)道用于防治枯萎病的有哈次木霉（ Trichoderma harzianum）和綠色木霉（ Trichoderma viride） [83]．電鏡掃描表明，哈茨木霉菌對(duì)枯萎菌絲有強(qiáng)烈的寄生作用，產(chǎn)生吸器直接穿入枯萎菌絲，分泌胞外溶菌酶，從而減輕病害 [84]． 吳石平等報(bào)道木霉菌與微量三唑酮配合對(duì)防治西瓜枯萎病有增效作用，在藥砂培處理的西瓜根分泌物作用下，尖孢鐮刀菌厚垣孢子萌發(fā)率較水砂培處理的低 [85]．田連生等將土壤中分離出的木霉菌株（ T41），通過對(duì)峙法對(duì)尖孢鐮刀菌進(jìn)行了體外拮抗作用測(cè)定評(píng) 價(jià)，并利用制備的木霉生防菌劑對(duì)番茄枯萎病進(jìn)行了室內(nèi)盆栽防治試驗(yàn)，結(jié)果表明木霉 T41 對(duì)番茄枯萎病的防效達(dá) 86%，并具有防效長(zhǎng)久和刺激作物生長(zhǎng)的作用 [86]．陳建愛等進(jìn)行的離體培養(yǎng)測(cè)定的試驗(yàn)結(jié)果表明：黃、枯萎病原真菌和木霉單獨(dú)培養(yǎng)均符合 S 生長(zhǎng)曲線．病菌與木霉對(duì)峙培養(yǎng)及病菌在涂木霉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng) 6 d 后比較病菌菌落半徑，結(jié)果表明病原真菌生長(zhǎng)受到極大限制，且部分病菌菌絲死亡．病菌在一定濃度棉萎靈中培養(yǎng)，生長(zhǎng)緩慢，但符合生長(zhǎng)曲 [84]．黎起秦等將從土壤中分離得到的 4 種拮抗真菌（ Trichoderma koningii, 茄科土傳病害生物防治拮抗菌劑生產(chǎn)工藝關(guān)鍵技術(shù)的研究與應(yīng)用 13 T. pseudokoningii, T. harzianum 和 Gliocladium sp.）分別用紫外光誘變，得到抗氧氮化銅、撲海因和多菌靈的變異菌株，這些變異菌株對(duì)西瓜枯萎病具有抑制作用 [87]． 細(xì)菌類生防菌 目前研究證明，有 18 個(gè)屬的細(xì)菌在植物土傳病害生防上有潛力，生防細(xì)菌的抑菌機(jī)制主要有營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、生態(tài)排斥、 對(duì)峙拮抗等 ．細(xì)菌在其生長(zhǎng)環(huán)境里能分泌胞外活性物質(zhì)，細(xì)菌素是其中的一大類，它具有很強(qiáng)的拮抗?；?[88]．利用產(chǎn)細(xì)菌素菌株防治植物病害的研究有許多成功報(bào)道，在實(shí)際應(yīng) 用中也取得了一定的效果 [87]．在枯萎病的防治中，已有報(bào)道的有熒光假單胞細(xì)菌 (Pseudomonas fluorescent spp.)、惡臭假單胞桿菌（ P. putida）和芽孢桿菌屬（ Bacillus spp.），其中研究最多的是芽孢桿菌．芽孢桿菌屬已在許多種作物上進(jìn)行了廣泛的控制病蟲害能力的測(cè)試，用于植物土傳病害防治的例子很多，它不僅有防病作用，而有增產(chǎn)作用 [89]．平板共生培養(yǎng)測(cè)定表明：芽孢桿菌 B361 對(duì)供試的 8 種植物病原真菌均有不同程度的拮抗性，其中含 B361 活菌液劑對(duì)玉米小斑病菌、小麥赤霉病 菌、黃瓜炭疽病菌、棉花枯萎病菌和水稻惡苗病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率依次為 %、 %、%、 %[90]． APS 抗真菌多肽是一種由蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)生的新型抗真菌環(huán)多肽，研究表明APS 具有廣譜抗菌性，對(duì)棉花枯萎病等種病原真菌及黑曲霉的孢子萌發(fā)具強(qiáng)烈的抑制作用，最小的MIC 達(dá) μgm11，對(duì)真菌的生長(zhǎng)亦具有強(qiáng)烈的抑制作用，隨著 APS 處理濃度的增加，抑制作用增強(qiáng) [91]． 拮抗菌 BS98 菌株在 BPY 液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析、 Sephadex G100 柱層析、 DEAE纖維素柱層析和 Sephadex G100 柱再層析后，分離純化得到的抗菌蛋白在電泳中顯現(xiàn)出三條帶，經(jīng)初步純化的抗菌蛋白對(duì)熱穩(wěn)定 [92]．孔建等報(bào)道枯草芽孢桿菌 B903 菌株對(duì)棉枯萎病等多種土傳鐮刀菌和蘋果輪紋病等的抑菌活性，電鏡和光學(xué)鏡觀察證實(shí)該菌抗菌物質(zhì)可使病菌細(xì)胞畸形、胞內(nèi)物質(zhì)外泄和細(xì)胞壁崩潰；盆栽和田間試驗(yàn)證明以 B903 菌液浸種可顯著降低棉炭疽病等棉苗和菠菜枯萎病 [93]．許煜泉等設(shè)計(jì)了一種新的高效篩選程序，從植物根際土壤中分離出一株具有 ACC脫氨酶活性的促生、拮抗雙功能假單胞菌株 M18，在培養(yǎng)皿中 M18 能有效地抑制黃瓜枯萎病菌以及多種其他枯萎病原菌和植物病原菌的生長(zhǎng)；用 M18 活菌浸種處理春黃瓜種子以及在大棚定植后，根際土壤中的病原菌顯著減少，對(duì)黃瓜幼苗的根系具有明顯的促進(jìn)作用 [94,95]． 鏈霉菌生防菌 鏈霉菌生防菌是通過分泌抗菌素抑制枯萎病菌的生長(zhǎng)，達(dá)到控病的目的．張克誠等通過室內(nèi)和田間試驗(yàn)，測(cè)定了從小麥根際篩選的一株鏈霉菌（ Streptomyces spp．） S5 對(duì)棉花苗期病害根腐病、紅腐病、炭疽病和棉花枯、黃萎病菌的防病效果，結(jié)果表明鏈霉菌 S5 具有廣譜抑菌作 用，對(duì)棉花枯黃萎病菌抑菌作用明顯 [96]．蔣細(xì)良等以西瓜枯萎病菌為實(shí)驗(yàn)菌，研究了中生菌素（鏈霉菌的一種）對(duì)絲狀真菌的作用，結(jié)果表明中生菌素能顯著地引起菌絲細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)凝集，對(duì)病原菌孢子的萌發(fā)具有強(qiáng)烈的抑制作用， μg/mL就能完全抑制孢子萌發(fā)，并具有殺死作用，對(duì)孢子的形成有較強(qiáng)的阻礙作用 [97]．農(nóng)抗 120 對(duì)西瓜枯萎病菌抑制作用結(jié)果表明，農(nóng)抗 120 對(duì)西瓜枯萎病菌孢子的萌發(fā)和菌絲的形態(tài)無明顯影響，對(duì)孢子的形成和菌絲生長(zhǎng)有一定抑制作用，能夠提高西瓜幼苗抗枯萎病菌毒素致萎的能力和幼苗體內(nèi)過氧化物酶活性 [98]，田間試驗(yàn)表明農(nóng)抗 120 對(duì)西瓜枯萎病具有一定的防治效果，對(duì)其防病機(jī)理初步研究表明農(nóng)抗 120 對(duì)其菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，同時(shí)還可以抑制小孢子的萌發(fā) [99]． 幾丁糖作用 賴凡等觀察了由蠅蛆殼制備而成的幾丁糖（殼聚糖），在 pH 為 時(shí)，其不同濃度 、 、 和 mg/mL 分別對(duì) 16 種常見植物病原真菌的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果表明隨著幾丁糖濃度的提高，抑制作用加強(qiáng) [100]． 茄科土傳病害生物防治拮抗菌劑生產(chǎn)工藝關(guān)鍵技術(shù)的研究與應(yīng)用 14 無致病力菌株 無致病力尖孢鐮刀菌的利用是應(yīng)用了弱株系交互保護(hù)作用的原 理，以產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性作用．然而作為微生物之間的這種干擾作用，往往因各種因素影響產(chǎn)生變化，如無致病力尖孢鐮刀菌會(huì)恢復(fù)致病力、失去競(jìng)爭(zhēng)力等，導(dǎo)致保護(hù)作用降低，因而，在大面積應(yīng)用上必須考慮選用無致病力尖孢鐮刀菌的適應(yīng)和變異的可能性，否則產(chǎn)生的后果將不堪設(shè)想 [68]． 枯萎病無致病力菌株能誘導(dǎo)寄主的抗病機(jī)制．王守正等研究了西瓜、黃瓜對(duì)枯萎病和炭疽病的誘導(dǎo)抗病機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西瓜、黃瓜經(jīng)枯萎病無致病力菌株誘導(dǎo)后與抗病性有關(guān)的過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶活性明顯增強(qiáng)，酚類物質(zhì)和木質(zhì)素含量增多．西瓜、黃瓜對(duì)枯萎病 的誘導(dǎo)抗病機(jī)制和黃瓜對(duì)炭疽病的誘導(dǎo)抗病機(jī)制基本一致．用從西瓜維管束中分離到的尖孢鐮刀菌無致病力菌株 F03 和茄病鐮刀菌無致病力株 F51 誘導(dǎo)處理西瓜幼苗，能使西瓜產(chǎn)生對(duì)枯萎病的抗性，無致病力菌誘導(dǎo)抗病效果與接種間隔天數(shù)相關(guān) [101]．黃瓜枯萎菌能誘導(dǎo)黃瓜幾丁酶的積累，但在誘導(dǎo)的速度和強(qiáng)度上，抗病品種和感病品種有明顯的差異．抗病品種 “津雜四號(hào) ”積累的幅度遠(yuǎn)大于感病品種 “澤研四號(hào) ”，升高的幅度是 “澤研四號(hào) ”的 倍 [102]． 益微菌作用 益微菌是一類有益微生物制劑的簡(jiǎn)稱，對(duì)枯萎病具有抑制作用 ．繆衛(wèi)國(guó)等用平板測(cè)定與生物測(cè)定法相結(jié)合，針對(duì)棉花枯萎病菌，將益微菌 AB3042， AB272 與病原菌一起導(dǎo)入植物體中，測(cè)定益微菌的抑制能力，結(jié)果表明在平板培養(yǎng)基益微菌對(duì)枯萎病菌具有較強(qiáng)抑菌能力，被抑制枯萎病菌的分生孢子數(shù)減少；在植物體中，兩種益微菌對(duì)棉花的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用 [103] 化學(xué)防治 殺菌劑 （ 1）咪唑類， 40%滅菌凈是以有機(jī)硫、咪唑類農(nóng)藥、添加助劑復(fù)配而成的新型殺菌劑，對(duì)枯萎病具有一定的防效 [104]．（ 2）安索菌毒清， 5%安索菌毒清防治棉花枯萎病的防效達(dá) ～ %，且隨濃度升高防效增加，生產(chǎn)上應(yīng)用采用 200 倍液， 200 mg/穴，定苗后灌根，生長(zhǎng)期灌根 2 次 [105]．（ 3）華光霉素，朱昌雄等通過測(cè)定 20 種助劑對(duì)華光霉素制劑的影響，結(jié)果篩選到 4 種對(duì)華光霉素的抑菌作用增效的助劑，用于西瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌和蘋果輪紋病菌防治防效較高 [106]．（ 4）菌線威，徐宗剛等用不同劑量的菌線威在西瓜定植和膨瓜期進(jìn)行灌根試驗(yàn)，結(jié)果表明每 m2 計(jì) 90 株西瓜，每次用菌線威 9 g 兌水 45 kg，于定植時(shí)和膨瓜初期 2 次灌根對(duì)枯萎病的防治效果較好，尤以每次用菌線 威 9 g 兌水 45 kg 的處理效果最好，在連續(xù) 2 年重茬田中應(yīng)用后，西瓜枯萎病病情指下降 [107]．（ 5）豐抗素，用 271 豐抗素在棉花各生育期用不同劑量次數(shù)噴施的結(jié)果表明，豐抗素對(duì)棉花枯萎病有一定的抑制作用 [108]．（ 6）硅唑類，李文明等合成了 20 個(gè)新型含硅唑類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng) IR， MS， HNMR 和元素分析確證，生物活性測(cè)定顯示一些化合物對(duì)棉花枯萎病菌等有較好的抑制活性，一些化合物對(duì)黃瓜灰霉病菌的抗性菌有很好的活性，討論了化合物的結(jié)構(gòu)與生物活性關(guān)系 [109]．（ 7）二硝基苯胺類，棉花感病品種播入含二硝基 苯胺類化合物（ FOV）的育苗土中，移栽后能明顯提高對(duì)棉枯萎病的抗性，效果達(dá) 70%．二硝基苯胺類化合物為非殺菌化合物，試驗(yàn)表明該化合物對(duì) FOV 的生長(zhǎng)無抑制作用，反而還能刺激菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)． FOV 處理過的棉苗萎病菌侵染率低 [110]．（ 8）枯萎立克，鄭仁富等報(bào)道在棉花枯萎病重發(fā)棉田，用 500 倍枯萎立克在棉花苗，蕾期各噴施一次能有效降低棉花枯萎病發(fā)病率，顯著提高棉花保苗效果，能顯著提高棉花產(chǎn)量，增加植棉經(jīng)濟(jì)效益 [111]．（ 9）銅制劑，羅巨海等報(bào)道通過銅大師不同比例拌種、灌根和噴施，對(duì)棉花苗期的根腐病、立枯病 、枯萎病均有防治效果，其中拌種、灌根、葉面噴施以 80 倍液效果最好，防治效果分別達(dá) ～ % [112]． 茄科土傳病害生物防治拮抗菌劑生產(chǎn)工藝關(guān)鍵技術(shù)的研究與應(yīng)用 15 除草劑 (氟樂靈 ) 田間試驗(yàn)結(jié)果，除草劑氟樂靈 48%乳油以 kg/hm2 作棉苗播前土壤處理，可明顯減輕棉花枯萎病的發(fā)生，在現(xiàn)苗期，施用氟樂靈后對(duì)感病品種滬棉 20xx 和抗病品種中棉 12 枯萎病株發(fā)病率的防治效果分別 ～ %和 ～ 70%[113]．氟樂靈（ 2 μg/g 土）能誘發(fā)枯萎病菌侵染后棉苗葉片和根莖部不同細(xì)胞定位過氧化物酶（ POD）活性的變化，結(jié)果表明（ 1）總可溶性 POD、胞內(nèi) POD、胞間 POD