【文章內(nèi)容簡介】 合防治技術(shù)進行研究，達到有效預防、控制和減少青枯病害和降低蔬菜農(nóng)藥殘留的目的，在減少對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失的同時保障人民生活健康。 茄科土傳病害生物防治拮抗菌劑生產(chǎn)工藝關(guān)鍵技術(shù)的研究與應用 5 三、國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)發(fā)展概況和趨勢 （一）青枯病研究進展 1．植物青枯病的癥 狀 植物青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的土傳病害。青枯雷爾氏菌（ R. solanacearum）侵害寄主（特別是茄科寄主）后，寄主植物（如番茄、辣椒、茄子等）在發(fā)病時出現(xiàn)青枯癥狀，即植物的葉子萎蔫下垂。發(fā)病初期，部分葉子發(fā)生萎蔫，發(fā)病中期，大部分葉子在陽光下發(fā)生萎蔫，在早晚恢復正常，發(fā)病后期，萎蔫的葉子無法恢復。青枯萎蔫作為青枯雷爾氏菌危害寄主植物的重要致害特征。但近年來，田間也發(fā)現(xiàn)呈枯萎或萎蔫病狀的青枯病植株， 1990 年在山東沂南縣調(diào)查發(fā)現(xiàn)煙草枯萎的病株，分離到 5 個細菌菌株，經(jīng)對各菌株致病性測定、格蘭氏 染色反應、細菌形態(tài)、培養(yǎng)性狀、生理生化測定和血清學反應的鑒定，結(jié)果表明：這５個菌株均屬于青枯雷爾氏菌（ R. solanacearum）（鄭繼法等， 1990）。 在河南省上蔡縣采集生姜萎蔫青枯病害姜塊，分離測定結(jié)果表明，引起生姜萎蔫青枯病病原細菌的是青枯雷爾氏菌（ R. solanacearum）。因而，青枯雷爾氏菌（ R. solanacearum）的不同致害特征，應根據(jù)受害寄主分離細菌的鑒定確定原因。 2． 青枯雷爾氏菌的形態(tài)特征 電鏡下觀察 ，青枯雷爾氏菌（ Ralstonia solanacearum）（ Smith， 1896）的基本形態(tài)為橢圓形至長橢圓形，革蘭氏染色為陰性，菌體大小為 ～ ～ 微米，兩極著色較深，不同作物上分離的青枯雷爾氏菌形態(tài)的大小、寬長比差異很大。極生鞭毛 1～ 4 根。 電鏡 4 萬倍， 大小， 寬長比 電鏡 4 萬倍， 大小，寬長比 電鏡 5 萬倍下顯示了莢膜構(gòu)造。 圖 4 青枯病 的為害癥狀 茄科土傳病害生物防治拮抗菌劑生產(chǎn)工藝關(guān)鍵技術(shù)的研究與應用 6 青枯雷爾氏菌菌落形態(tài) 番茄青枯病 電鏡 1 萬倍下顯示鞭毛 青枯雷爾氏菌菌株顯微照片 圖 5 青枯雷爾氏菌的形態(tài)特征 3．青枯病發(fā)病規(guī)律和侵染循環(huán) 青枯雷爾氏菌（ R. solanacearum）生長極限溫度為 10～ 41℃ ，最適溫度為 30～ 37℃ ，病菌發(fā)生與土壤的溫度、含水量和酸堿度密切相關(guān)，當土壤溫度為 22～ 27℃ ，含水量超過 25%，氫離子濃度 nmol/L （ ）時，發(fā)病最重，因此高溫、高濕易誘發(fā)青枯病。此外，植株幼苗生長不壯，多年連作，中耕傷根，低洼積水，土壤偏酸等，均可促進發(fā)病，加重為害。由于 青枯雷爾氏菌（ R. solanacearum）在土壤中存活時間長、傳播快，用藥劑防治不能有效地控制病害蟲的發(fā)生，導致連作區(qū)煙草發(fā)病更嚴重，減產(chǎn)高達 60%以上，甚至失收。青枯雷爾氏菌（ R. solanacearum）在一般條件下是從植株根部傷口侵入，但不能從植物氣孔侵入。溫室試驗證明，把植株的根用消毒刀弄傷后立即接種，植株感病受害嚴重，而 24 小時后再接種植株幾乎不受傷害。幼苗移栽時造成的根部傷口比成苗傷口更易引起青枯雷爾氏菌侵入。接種量大時，就是沒有傷口，此菌也能侵入，一般是從次生根萌發(fā)處或根毛與皮層連接處侵 入，侵入率較低。病菌進入寄主組織后即可繁殖，并進入維管束，繼續(xù)向其他組織擴展蔓延，同時分泌果膠酶、纖維素毒等，分解寄主的中膠層，使寄主皮層和髓部組織殘廢腐爛。寄主組織破壞腐爛后，病菌落入土壤中或堆肥中越冬，來年碰到有利條件，繼續(xù)侵入寄主為害。 4．植物青枯病的生物防治研究進展 （ 1）無致病力青枯雷爾氏菌的利用 從 80 年代初開始，用無致病力青枯雷爾氏菌菌株防治植物青枯病在國內(nèi)外青枯病的生物防治研究和應用方面投入人力最多，發(fā)表論文最多。用無致病力產(chǎn)細菌素的青枯雷爾氏菌（ ABPS） 121 菌株、日 本 Tanaka 等用 ABPSM4S 菌株及其噬菌體、日本的 Hara 和 Ono 用 ABPS OM2 菌株、朝鮮Yi 用 ABPS Y611 菌株防治煙草青枯病，任欣正等用 ABPS 菌株 MA7 和 nOE104 防治番茄青枯病，均取得溫室或小區(qū)試驗的良好的防效，但后期防效降低，大田試驗尚未取得成功，這可能性主要由于 ABPS 菌株在大田土壤中不能大量繁殖，缺乏與其它微生物的競爭力所致。鄭繼法等研究了煙草細菌性青枯雷爾氏菌的無毒產(chǎn)細菌素菌株對煙草青枯雷爾氏菌 411 的防治作用。結(jié)果指出：用浸根圖 6 青枯病 原菌 侵染循環(huán) 茄科土傳病害生物防治拮抗菌劑生產(chǎn)工藝關(guān)鍵技術(shù)的研究與應用 7 法處理 A35， A43， A14 三個無毒 菌株對致病菌 411 均有防治效果。其中 A35 防效最好，病毒情指數(shù)比治作用，病情指數(shù)比對照降低達 80%，推遲發(fā)病 25 天，說明在煙草根際保持較高數(shù)量的 A35，是提高其防治效果的必要條件。 （ 2）芽孢桿菌的利用 Bacillus 、易保存、有效期長等特性，較之其它生防菌更受到廠家和商家的青睞。用于防治青枯病試驗的芽孢桿菌有：多粘芽孢桿菌 FU6（ Bacillus polymyxa）（ Aspiras et al., 1985）、枯草芽孢桿菌（ B. subtilis）（ Phae et al., 1993）、凝固芽孢桿菌 BA24 (B. coagulans)、蠟狀芽孢桿菌BA3 （ B. cereus）（ Silveira et al., 1995）、巨大芽孢桿菌 B1301（ B. megaterium）等。 劉波等從番茄病株篩選到青枯病生防菌 ANTI8098 菌株，對番茄青枯病有較好的防效，經(jīng)農(nóng)業(yè)部藥檢所指定的田間藥效測定表明：對茄子青枯病的防效在 7585%，菌株經(jīng)德國菌種保存中心（ DSMZ）鑒定為蠟狀芽孢桿菌（ Bacillus cereus， strain ANTI8098A，鑒定號： ID011000），并對番茄青枯病菌的致病力分化以及生防菌形態(tài)特征、生化特性、培養(yǎng)特性、抑菌機理、生產(chǎn)工藝、生物測定、大田試驗進行了研究。印度 Aunratha 和 Gnanamanickam（ 1990）用 Bacillus 和 B36菌株防治香蕉、茄子和番茄青枯病，分別取得了溫室試驗 50%、 61%和 95%，田間試驗 50%、 49%和 36%的防效，同時植株鮮重和生物產(chǎn)值也得到提高。試驗防效在 4595%。 （ 3）鏈霉菌的利用 自然界 70%以上的抗生素由 Strepromyces ，所以很自然就有人將此類菌直接用于病害的生防。 Elabyard 等（ 1993）交替使用鏈霉菌菌株－灰白鏈霉菌（ Strepromyces canescens）、檸檬熒光鏈霉菌（ Strepromyces citreco fluorescens）和極美鏈霉菌（ Strepromyces pulcher）分別制成種衣劑處理番茄種子，可在 4263 天內(nèi)控制 R. solanaceans 造成的青枯病。 （ 4）假單胞桿菌的利用 通過分析研究，番茄青枯雷爾氏菌的拮抗菌多數(shù)屬于熒光假單孢菌屬。經(jīng)多次分離 篩選，從土壤中分離出了對作物無不良影響而對番茄青枯雷爾氏菌有拮抗作用的菌株 104 個。經(jīng)試驗，利用這種拮抗菌防治番茄青枯病，當發(fā)病株率在 25%以下時，防治效果可達 100%；當發(fā)病株率達 45%時，防治效果為 50%左右。 （ 5）菌根真菌的利用 菌根真菌由于一部分在根外，一部分在根內(nèi)，而占有獨特的生態(tài)位。它們從寄主得到營養(yǎng)成分供應，這一優(yōu)勢使它在與根系更緊密的聯(lián)系中，獲得更大的更有功能的總生物量，并以此增加對植物的作用（與僅限于根際的其它微生物相比）。因此菌根真菌作為根際群落的組成，其重要作用受到越來越廣泛 的承認。有些人亦捷足先登，將之用于植物病害的生物防治。印度 Suresh 和 Rai（ 1991）發(fā)現(xiàn)受泡囊叢枝狀菌（ VAM）感染的番茄根圍菌根提取物可抑制 。在菲律賓的一項研究中，發(fā)現(xiàn)一種菌根可減弱番茄細菌性青枯病的嚴重程度（ Hayward， 1991）。 VAM 的作用可能是建立了一種機械屏障，阻止病原細菌進入寄主組織。 （ 6）青枯拮抗菌的利用 黎定軍等（ 1997）對來自湖南嘉禾、郴縣、永州、永興、桂陽和湘西等 23 個煙區(qū)青枯病發(fā)病較輕的煙地根際土壤進行了室內(nèi)細菌分離，獲得 317 個菌株。測定了這些菌株對青枯雷爾氏菌拮抗性，篩選出有明顯抑菌作用的菌株 48 個，其中最有效的拮抗菌株 10 個。對該 10 個菌株相互之間的拮抗性測定結(jié)果表明，有６個菌株相互之間無拮抗作用，可在煙草青枯病的生物防治中應用。郭堅華等（ 1996）利用抑菌圈 定殖力雙重測定法成功地篩選了青枯病生防細菌，該研究首先用平皿抑菌圈法，篩選出 55 個拮抗青枯雷爾氏菌的細菌菌株，將番茄幼苗在各菌菌懸液中浸根 12ｈ后，栽種于溫室未滅菌的土壤中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：有 22 個菌株在幼苗根部的定殖能力較強（終定殖密度大于 104cfu/g 根）， 茄科土傳病害生物防治拮抗菌劑生產(chǎn)工藝關(guān)鍵技術(shù)的研究與應用 8 其中革蘭氏 陰性土壤細菌占同類菌的 ％，革蘭氏陽性土壤細菌占同類菌的 ％，其中有 17 個拮抗菌菌株在番茄幼苗根部的定殖密度超過所有致病菌。丁愛云等（ 1999）從山東滕州、臨沂等縣（市）的煙草、番茄和辣椒根際采集土壤樣本 15 份，經(jīng)內(nèi)分離純化獲得細菌 102 株、放線菌 55 株。以煙草赤星病菌、野火病菌和青枯雷爾氏菌等為對象，對 157 個菌株進行平板對峙培養(yǎng)法抑菌測定，分別篩選出有拮抗活性的細菌 33 株和放線菌 22 株。鄭福慶等（ 1998）從廣東省不同地方、不同作物的根圍及根際土壤中，篩選到對番茄青枯病病菌具抑菌效果的菌株 20 個，盆栽試驗表明，這些菌株可推遲番茄青枯病發(fā)生 1035 天，防治效果高達 80%。 （ 7）基因工程生防菌的利用 中國農(nóng)科院植保所康耀衛(wèi)等采用轉(zhuǎn)座子 Tn5 誘變 R. solanacearum，獲得了世界首例植物青枯雷爾氏菌胞外蛋白輸出缺失突變體（簡稱 eep 突變體）。該突變體在缺失了多種胞外蛋白外輸功能后，也失去了對寄主的致病力。 eep 突變體接種到植物體內(nèi)后，在局部范圍內(nèi)有一定的定殖能力。溫室和田間小區(qū)生防試驗中，該突變體在 30 天以內(nèi)有一定防治效果。雖然防效不甚理想，但在理論上該項研究代表 了一個新的發(fā)展方向。而且，當 eep 突變體經(jīng)過改造后，完全有可能進入大田實際應用。法國 Trigalet 和 Demery 發(fā)現(xiàn)有 6 個 Tn5 誘變產(chǎn)生的無致病力青枯突變株，它們能在番茄莖、葉部定殖，它們與強致病菌株以等量或低量接種時，可阻止致病菌的增殖，具有較好的生防前景。 Frey等也得到了相似的結(jié)果。 （ 8） 植物青枯病的 生防菌劑 研究 關(guān)于青枯生防菌的生產(chǎn)工藝探索和研究，國內(nèi)外研究者通過改進生產(chǎn)工藝，如營養(yǎng)配方、通氣狀態(tài)等，來提高生防菌的發(fā)酵水平，來提高生防菌的防治效果。關(guān)于青枯生防菌土壤存活基質(zhì)配方研究，臺灣 黃振義和孫守恭教授年發(fā)現(xiàn)向土壤中施用一種名為 SH 有機無機復合的添加物，能提高土壤中微生物含量，有效地防治和減輕青枯病害。將這種混合物做為基質(zhì)，填充于研究的生防菌劑中，施用后可有利于生防菌在土地中生存繁殖，試驗結(jié)果表明，用后 7 天土壤生防菌仍有施用時的70%以上，防效增加 7%。但由于該混合物是農(nóng)副產(chǎn)品，營養(yǎng)含量低、體積大，是它最大的不足之處，所以變成填充劑、做成活性基質(zhì)將會影響制劑的效價，會影響生防菌的使用，生防菌存活基質(zhì)有待于進一步的研究。 （二）枯萎病研究現(xiàn)狀 1．枯萎病的發(fā)生與危害 枯萎病 原 枯萎病是一類植物病害的總稱，因病原菌的侵害，造成植物枯死萎蔫．枯萎病有細菌性病原（如香蕉細菌性枯萎病等 [1]）和真菌性病原兩種 [2]．本文所指的枯萎病為真菌性病原，是由鐮刀菌屬真菌寄生引起的一種世界性的真菌土傳病害 [3]，其中尖孢鐮刀菌 (Fusarium oxysporum Schl.)是主要病菌種類之一．尖孢鐮刀菌屬 半知菌類（ Fungiimperfecti）、梗孢目（ Moniliales）、痤孢科（ Tubercular）、鐮刀菌屬（ Fusarium）．自從 Snyder 和 Hansen（ 1940）把鐮刀 菌屬美麗組內(nèi)的種合并為 1 個，成為尖孢鐮刀菌（ F. oxysporum） [4]． 寄主范圍 （ 1）經(jīng)濟作物：棉花、油桐、蓖麻、亞麻等 [5,6]．（ 2）茄科作物：番茄、胡椒、茄子、煙草、馬鈴薯等 [7,8]．（ 3）瓜類作物：黃瓜、節(jié)瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆、甜瓜、絲瓜、白瓜、越瓜、苦瓜、葫蘆瓜、哈密瓜等 [9]．（ 4）豆科作物：大豆、四季豆、豇豆、豬屎豆、豌豆等 [10]．（ 5）花卉植物：康乃馨、郁金香、魚尾菊、非洲菊、鳶尾、水仙、翠菊、合歡、百合、仙人掌、穿