【正文】 切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。（2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。（3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。（4）載體DNA必需是安全的，不會對受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。（5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。：目的基因的片段與運(yùn)載體在生物體外連接形成重組DNA分子后。用人工方法使體外重組的DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，主要是借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。例如，如果運(yùn)載體是質(zhì)粒，受體細(xì)胞是細(xì)菌，一般是將細(xì)菌用氯化鈣處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，就可以隨著受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌的繁殖速度非?？欤诤芏痰臅r間內(nèi)就能夠獲得大量的目的基因。：重組的DNA分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)就會 大量擴(kuò)增。：運(yùn)用DNA分子雜交技術(shù)來檢測目的基因，分子雜交技術(shù)檢測mRNA，抗原抗體雜交技術(shù)檢測蛋白質(zhì)二．酵母基因工程菌在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用：隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，酵母在其發(fā)酵的形式、原料成份及工藝流程等方面都發(fā)生了極大的變化。新的基因工程酵母茵具有提高CO 的產(chǎn)速率，增強(qiáng)對外界環(huán)境壓力的抵抗力，并且還能夠產(chǎn)生新的蛋白和其它代謝物來改進(jìn)面包等的風(fēng)味．延長酵母的保存期限。酵母具有發(fā)酵面團(tuán)的特性，它能產(chǎn)生CO 使面包保持蜂窩結(jié)構(gòu)，同時還賦予面包特殊的風(fēng)味，因此很早就為人們所利用。產(chǎn)氣速率在酵母的發(fā)酵過程中是極為重要的，它不僅與面團(tuán)的成份有關(guān)，還與面包酵母的內(nèi)在性質(zhì)密切相關(guān)。為了適應(yīng)冷凍技術(shù)在面包發(fā)酵方面的應(yīng)用，須使酵母在冷凍后仍保持較快的生長速率和較強(qiáng)的發(fā)酵能力。而大量資料表明，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建酵母基因工程菌，不僅可以改善面包酵母內(nèi)在的發(fā)酵特性，如產(chǎn)氣速率、發(fā)酵速度、發(fā)酵能力等，還可以提高發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量，擴(kuò)大原料利用范圍等。酵母生產(chǎn)，一般采用糖蜜或其它碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞并能獲得較高的菌體濃度，但如果利用基因技術(shù)，則會給酵母的工程生產(chǎn)帶來新的突破。例如乳清是奶酪業(yè)的一種無用副產(chǎn)品，主要成份是乳糖，其降解過程需要消耗大量的氧，因此對環(huán)境存在潛在污染。面包酵母由于缺乏B一半乳糖苷酶和乳糖透性酶，不能利用乳清。但乳清可以被K．1aetis和K．fragilis所利用，將K．1aetis中分別表達(dá)B一半乳糖苷酶和乳糖透性酶的LAC4和LAC12基因或E．eoli(或A．niger)的B一半乳糖苷酶基因構(gòu)建至釀酒酵母，就可使釀酒酵母利用乳清發(fā)酵，其生產(chǎn)效果可與酵母在糖蜜中發(fā)酵相媲美。此外，構(gòu)建可降解淀粉和木質(zhì)纖維素的基因工程酵母，不僅可簡化上述兩種原料的預(yù)處理過程，降低成本，還避免了在預(yù)處理過程中可能混入的一些不利于酵母生長的物質(zhì)，從而提高酵母產(chǎn)品質(zhì)量。但由于降解淀粉或木質(zhì)纖維素往往需要多種酶共同作用，因此需要在酵母中轉(zhuǎn)人多種基因方可發(fā)揮作用。重組DNA技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使構(gòu)建具有新性質(zhì)的面包酵母成為可能，這將給面包生產(chǎn)市場帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。在不久的將來，面包酵母將會在新的原料如淀粉、纖維素廢物或乳清中生長。更經(jīng)濟(jì)、更環(huán)保和更可行的工藝也將應(yīng)運(yùn)而生。同時，隨著酵母生物技術(shù)的發(fā)展，那些存在潛在污染的資源也將變成寶藏。利用基因克隆技術(shù)使外源酶在酵母中表達(dá)，則可避免使用添加劑，節(jié)約成本，改進(jìn)終產(chǎn)品的質(zhì)量，減少或消除工作人員對添加酶的過敏反應(yīng)。重組菌株的商業(yè)應(yīng)用也會遇到諸多問題，如技術(shù)缺陷以及公眾接受方面。再比如，改進(jìn)菌株的CO2產(chǎn)氣速率,在有效的縮短酵母發(fā)酵時間的同時，也大大減少了面包中的香味成分。但無論如何，目前的面包生產(chǎn)的確需要這類面包酵母基因工程菌，通過對酵母特性的控制，可直接影響面包生產(chǎn)的技術(shù)工藝和最終產(chǎn)品質(zhì)量。：葡萄酒釀酒酵母是葡萄酒發(fā)酵當(dāng)中最主要的微生物，它的性能不僅直接影響葡萄酒的產(chǎn)量、質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)性。還對葡萄酒特色的形成有很大影響。為了提高葡萄酒的市場競爭力和商業(yè)價值．縮短發(fā)酵周期和降低生產(chǎn)成本，進(jìn)而提高企業(yè)的競爭優(yōu)勢和獲利能力，我們有必要對釀酒酵母進(jìn)行選育、基因改良和構(gòu)建工作。隨著1996年釀酒酵母全基因組測序工作的完成．利用基因工程技術(shù)構(gòu)建釀酒酵母基因工程菌已經(jīng)成為當(dāng)前的主流。并且，科學(xué)家們也為釀酒酵母相應(yīng)地構(gòu)建了多種有救的質(zhì)粒載體及探索出相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)化方法。葡萄酒中蘋果酸含量較高時，會影響酒的品質(zhì)，需要對其進(jìn)行降酸處理。由于釀酒酵母分解蘋果酸的能力比較低，因此通常在葡萄酒酒精發(fā)酵后接種乳酸前進(jìn)行蘋果酸一乳酸酵．從而使葡萄酒的酸度降低網(wǎng)。此外。粟酒裂殖酵母通過蘋果酸一酒精發(fā)酵，也能將蘋果酸分解為酒精和CO2。但由于蘋果酸一酒精發(fā)酵會產(chǎn)生異味物質(zhì)．因此不能直接用于葡萄汁(酒)的生物降酸。隨著對乳酸菌和酵母蘋果酸代謝相關(guān)酶系研究的深入及分子遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，將乳酸菌和粟酒殖酵母中蘋果酸降解相關(guān)基因?qū)脶劸平湍讣?xì)胞中?？梢詷?gòu)建蘋果酸乳酸酵母和蘋果酸一酒精酵母，使之既能進(jìn)行酒精發(fā)酵，又能降解蘋果酸。從而簡化葡萄酒的發(fā)酵工藝。： 幾個世紀(jì)以來，釀酒酵母一直被用于食品發(fā)酵生產(chǎn)，但其不能發(fā)酵利用淀粉。但淀粉價格低廉，是一種很有潛力的生物資源．發(fā)酵行業(yè)一直借助淀粉酶來應(yīng)用淀粉。不過外加酶可能對啤酒風(fēng)味等產(chǎn)生不利影響，既浪費(fèi)原材料又提高生產(chǎn)成本。與釀酒酵母有很近親緣關(guān)系的糖化酵母可分泌糖化酶利用淀粉和糊精，但同時也賦予啤酒濃重的酚醛味，不適于啤酒生產(chǎn)。結(jié)林卡油脂酵母可以分泌q一淀粉酶、糖化酶、異淀粉酶等淀粉水解酶，是有效的水解淀粉的酵母。但其生長緩慢，乙醇耐受力低，同樣不適于啤酒生產(chǎn)。所以對釀酒酵母進(jìn)行遺傳改造使其直接利用淀粉是解決這些問題的最佳方案。近幾年用不同來源的d一淀粉酶基因構(gòu)建釀酒酵母工程菌的研究不少。其中包括來自動植物組織的Ⅱ淀粉酶基因；來自原核生物解淀粉芽孢桿菌，U淀粉脫枝假單孢菌的d一淀粉酶基因；來自低等真核生物西方許旺酵母的口一淀粉酶基因及不同曲霉的淀粉酶基因。各種來源的淀粉酶基因在釀酒酵母工程菌中表達(dá)效率不盡相同。通過基因轉(zhuǎn)化可以向工業(yè)菌株引進(jìn)新基因，使其具有新性狀，利于發(fā)酵生產(chǎn)。參考文獻(xiàn)：[1]張春暉。夏雙梅．蘋果酸降解相關(guān)基因在釀酒酵母中的表造叫；中國生物工程2003(2)[2]韓北患，李雙右 葡萄酒醵漕酵母茵基因工程改良【J】。中國釀造知2007(5)[3]廖雅靜。基因工程改造稽萄酒品質(zhì)【J】．生物技術(shù)世界2005(12M)[4]Randez—Gil F，Sanz P，Prieto J A．Engineering baker’S yeast：room for improvement[J]．Trends Biotechno1．1 999，1 7(6)：237244．[5]Attfield P V，Kletsas S．Hyperosmotic stress response bystrains of bakers’yeasts in high sugar concentration medium[J]．Lett Appl Microbio1．2000，3 1(4)：323—327．[6]Brown A J P．Gene regulation during m0rph0genesis in Candida albicans[J]．Trends Biotechno1．。1 997。1 5：445—447． [7]Kondo K，Inouye M．TIP 1，a cold shockinducible gene ofSacchar0myces cerevisiae．J Biol Chem [J]．200 1，266(2 6)：l7537l7544．[8]陳三風(fēng)，劉德虎現(xiàn)代微生物遺傳學(xué)．化學(xué)．f．業(yè)出版社，北京，2002． [9]管敦儀，啤酒丁業(yè)手冊中國輕1．業(yè)山版利，1998