【正文】 組織的修復。7．實現(xiàn)三維培養(yǎng)干細胞的近紅外量子點標記三維熒光成像技術和磁性納米粒子的活體磁共振成像。發(fā)表論文510篇。第五年1．確定調(diào)控三維培養(yǎng)干細胞自我更新和定向分化信號調(diào)控網(wǎng)絡的關鍵分子的基礎上，對其上下游的調(diào)控因子及調(diào)控機制進行深入研究。2．進一步確定神經(jīng)干細胞體內(nèi)維持、定向分化調(diào)控網(wǎng)絡。進一步從病理學上分析外源神經(jīng)干細胞移植后的維持與分化。3．預備結題。1．建立干細胞三維培養(yǎng)體系和干細胞納米示蹤成像方法。2．豐富和完善干細胞自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡，建立調(diào)控三維培養(yǎng)干細胞自我更新信號和定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡。2．確定神經(jīng)干細胞體內(nèi)維持、定向分化相關的幾個靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡；完成外源神經(jīng)干細胞參與神經(jīng)退行性疾病損傷組織修復的功能評估。發(fā)表論文510篇。一、研究內(nèi)容本項目的主要研究內(nèi)容如下：（一）干細胞三維培養(yǎng)體系的建立1）干細胞培養(yǎng)三維支架材料的制備分離純化膠原蛋白，制備三維支架材料，使其具有良好的生物相容性、適宜的硬度和孔隙結構，制備適合干細胞培養(yǎng)的三維膠原支架材料。細胞外基質成份膠原蛋白本身為機體內(nèi)細胞所處三維環(huán)境中的固有成份，其具有良好的細胞相容性，可最大限度地在體外模擬體內(nèi)干細胞生活的環(huán)境。2）三維膠原支架材料的修飾、優(yōu)化在膠原支架材料的基礎上，考慮多方因子和因素，將微環(huán)境中調(diào)控干細胞自我更新和定向分化的其它細胞外基質成份、信號分子或支持細胞等因素整合到膠原支架材料上，對三維膠原支架材料進行修飾優(yōu)化，以最大限度的模擬體內(nèi)干細胞自我更新和定向分化的環(huán)境。3）干細胞三維培養(yǎng)體系的建立將干細胞接種于三維支架材料上，檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞的自我更新、代謝、形態(tài)學及亞細胞結構的變化，包括用免疫染色及活細胞成像技術等觀察細胞粘附特性及細胞骨架結構、細胞遷移和運動特性等。干細胞選擇多潛能干細胞（ES細胞和iPS細胞）和成體干細胞（神經(jīng)干細胞、心肌干細胞、骨骼肌干細胞）。（二）三維培養(yǎng)干細胞的發(fā)育潛能與自我更新調(diào)控網(wǎng)絡研究1）ES細胞是最為人們熟知的多能性細胞，iPS細胞具有ES細胞相似的多能性。我們2）在建立在建立胚胎干細胞三維培養(yǎng)體系的基礎上，探索三維培養(yǎng)胚胎干細胞的發(fā)育潛能，利用嵌合以及四倍體補償?shù)确椒ㄨb定三維培養(yǎng)胚胎干細胞體內(nèi)發(fā)育潛能及細胞多能性，并與二維培養(yǎng)體系下干細胞的發(fā)育潛能相比較。2）細胞多能性的維持受到內(nèi)源的轉錄因子Oct4和Nanog等調(diào)控網(wǎng)絡的控制，外源信號和內(nèi)源的轉錄因子之間協(xié)同作用共同維持ES細胞的不分化狀態(tài)。我們擬在建立ES細胞和iPS細胞三維培養(yǎng)體系基礎上，研究調(diào)控細胞多能性的這些因子之間的調(diào)控網(wǎng)絡，解析其如何相互協(xié)同共同控制多能性細胞的不分化狀態(tài)。并與二維培養(yǎng)體系下干細胞的自我更新調(diào)控網(wǎng)絡相比較。（三）三維培養(yǎng)干細胞的定向分化調(diào)控網(wǎng)絡研究研究將以向神經(jīng)、心肌、骨骼肌的分化研究為主，主要內(nèi)容如下：1）檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌、成肌干細胞分化過程中的細胞學屬性，包括細胞形態(tài)變化、標志蛋白表達及細胞功能等。檢測并比較干細胞定向分化過程中亞細胞結構水平的變化，用免疫染色及活細胞成像技術等觀測細胞粘附特性及細胞骨架結構、細胞遷移和運動特性等。2）運用生化方法檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞在分化過程中受外界信號因子誘導產(chǎn)生的細胞內(nèi)信號通路的動態(tài)變化，分析它們各自信號轉導途徑整合的特性。其中神經(jīng)細胞研究將以Erk及mTOR信號通路為主。心肌細胞研究利用已建立的人胚胎干細胞向心肌分化的體外培養(yǎng)模型，在三維培養(yǎng)條件下利用基因芯片或深度測序的方法取得基因表達譜，進行生物信息學分析，構建三維條件下心肌分化的轉錄因子網(wǎng)絡。骨骼肌細胞的研究將以PI3K/AKT/GSK3β信號通路為主。（四）三維培養(yǎng)干細胞自我更新與定向分化的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡研究1）外界的誘導物如生長因子或其它一些小分子可以和細胞表面的受體結合并在細胞內(nèi)引起級聯(lián)放大的信號轉導反應。這些級聯(lián)放大的信號可以控制或調(diào)節(jié)一系列參與細胞生長、增殖和分化的細胞內(nèi)反應，如基因表達的上調(diào)或下調(diào)以及蛋白質的合成，修飾和降解。蛋白質激酶是介導細胞外刺激引起的細胞內(nèi)信號轉導級聯(lián)反應的最重要的分子，干細胞的自我更新是受磷酸化蛋白嚴密調(diào)控的。我們將系統(tǒng)而定量地分析在二維和三維培養(yǎng)條件下多潛能細胞與成體干細胞自我更新和定向分化過程中蛋白質組和磷酸蛋白質組的差異，從而找出在三維培養(yǎng)條件下控制干細胞自我更新與定向分化的特異性的調(diào)控網(wǎng)絡。2）microRNA作為表觀遺傳調(diào)控的重要手段在干細胞自我更新和定向分化調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用。我們將用microRNA芯片進行高通量篩選，利用生物信息學方法，比較二維和三維培養(yǎng)的條件下多潛能細胞與成體干細胞的非編碼RNA的表達差異，發(fā)現(xiàn)共同及特異表達的非編碼RNA；對這些非編碼RNA基因的基因組位置、結構等基因組特征進行分析并利用實驗生物學方法探討其轉錄調(diào)控機制。（五）干細胞體內(nèi)維持分化與功能研究1）線蟲內(nèi)源神經(jīng)干細胞維持與分化的關鍵因子神經(jīng)干細胞在體內(nèi)受到niche微環(huán)境內(nèi)多種因子、信號通路的調(diào)控。我們將首先建立線蟲神經(jīng)干細胞體內(nèi)觀察體系，進行全基因組RNAi篩選和化學誘變。然后通過內(nèi)源啟動子融合熒光實驗，探明相應調(diào)控因子的組織表達譜。運用細胞自主性拯救實驗探明該調(diào)控因子信號是如何調(diào)控內(nèi)源神經(jīng)干細胞的維持與分化。2）同源干細胞分化調(diào)控因子在哺乳動物干細胞分化中的作用研究哺乳動物中相對應的同源干細胞分化調(diào)控因子，利用RNAi和基因敲除技術研究這些調(diào)控因子如何影響二維和三維培養(yǎng)干細胞的維持與分化。3）三維培養(yǎng)神經(jīng)干細胞在小鼠紋狀體區(qū)的維持、分化與神經(jīng)回路的重建三維培養(yǎng)神經(jīng)干細胞將具有更好的自我更新潛能和分化潛能。我們將使用近紅外量子點和磁性納米顆粒對三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞在體外進行標記。經(jīng)納米材料示蹤標記的神經(jīng)干細胞將通過立體定位的方法直接注入到包裹小鼠紋狀體的腦室側壁，即神經(jīng)干細胞的niche區(qū)。在細胞導入后不同時間分別使用增殖細胞、神經(jīng)前體細胞、分化細胞、成熟神經(jīng)元、神經(jīng)突觸等特異的分子標記，系統(tǒng)地檢測外源神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的增殖、分化行為以及功能回路的建立。同時使用核磁共振活體成像技術，對干細胞移植動物后進行三維、非破壞性納米技術示蹤以分析外源神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的自我更新、定位、遷移、分化等。4）外源神經(jīng)干細胞參與神經(jīng)功能的恢復外源神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的分化是否可以產(chǎn)生有功能的神經(jīng)元，并參與神經(jīng)功能的恢復？我們將使用神經(jīng)退行性疾病模型小鼠—舞蹈病模型小鼠作為外源神經(jīng)干細胞的受體，這樣干細胞移植后通過檢測舞蹈病模型小鼠的運動協(xié)調(diào)能力可以直接從功能上評估外源干細胞參與神經(jīng)組織修復的能力。我們將使用Rotarod、Beambalance、Gait analyis等方法評估外源神經(jīng)干細胞參與神經(jīng)功能的恢復能力。（六）干細胞的納米示蹤與成像技術1）高量子效率、高生物相容性量子點的制備（1） 高量子效率、高生物相容性量子點的制備：在我們已有工作的基礎上，進一步改進量子點合成技術，開發(fā)高量子效率的、熒光范圍從可見光區(qū)到近紅外光區(qū)的量子點，并提高量子點的生物相容性，滿足三維培養(yǎng)的干細胞和活體干細胞標記和成像。（2） 高生物相容性和高弛豫率磁性納米顆粒的制備：通過控制納米粒子的粒徑、化學成分以及表面性質使其具有良好的弛豫性能和生物相容性。2）三維培養(yǎng)干細胞的特異性標記：與課題1和2進行合作，針對三維培養(yǎng)的干細胞及其亞細胞結構，分別用相應的識別分子（如抗體、適配體、信號肽等）對量子點進行特異性修飾，對細胞骨架組分、細胞因子（如Wnt、FGF、BMP、Notch和TGFβ等）及相關受體、細胞內(nèi)信號通路中蛋白質磷酸化相關蛋白、非編碼RNA進行特異性標記。3）活體干細胞的特異性標記：用近紅外量子點或磁性納米粒子對三維培養(yǎng)的干細胞在體外進行標記，采用立體定位注射的方法導入小鼠體內(nèi)，利用近紅外量子點的熒光信號或磁性納米粒子的核磁信號對活體內(nèi)的干細胞進行定位與跟蹤，為研究其在體內(nèi)生理環(huán)境下的增殖與分化機制提供證據(jù)。4）三維培養(yǎng)干細胞的近紅外熒光成像技術：利用單分子/單量子點熒光共定位技術，研究修飾后的近紅外量子點對細胞骨架組分、細胞因子等的特異性標記性能。針對紅外量子點的激發(fā)與發(fā)射光譜特性，研究適合近紅外成像的激光共聚焦顯微技術；研究近紅外量子點在三維培養(yǎng)干細胞中的示蹤技術，發(fā)展基于熒光成像的二維、三維培養(yǎng)干細胞分化過程定量分析手段。5）活體干細胞的三維、非損傷性示蹤技術：研究近紅外光在活體干細胞中的散射與吸收性質，開發(fā)利用近紅外量子點標記的活體動物熒光成像系統(tǒng)；并且利用活體動物熒光成像系統(tǒng)，對移植體內(nèi)的近紅外量子點標記的干細胞進行三維示蹤；結合納米磁性粒子造影技術，通過核磁共振成像對磁性納米粒子標記的干細胞在活體內(nèi)的維持和分化進行成像示蹤。內(nèi)容總結
（1）二、預期目標
本項目的總體目標：
通過本項目的實施，建立干細胞三維培養(yǎng)和完善干細胞納米示蹤技術，解析干細胞自我更新與分化過程中遺傳與表觀遺傳的調(diào)控網(wǎng)絡，為干細胞的應用奠定基礎
（2）此外，我們已發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 通過STAT3p63 JaggedNotch 級聯(lián)調(diào)控細胞維持細胞增殖和分化之間的平衡