【正文】 之間的相互關(guān)系。4，完成精原干細胞和胚胎干細胞〔誘導多能干細胞〕組蛋白修飾模式的檢測和比擬；5，完成生物信息學分析結(jié)果確定的相關(guān)基因?qū)毎麥p數(shù)分裂的影響研究，初步完成相關(guān)載體、DNA文庫的構(gòu)建，篩選與視黃素受體相互作用的蛋白，確定12個參與減數(shù)分裂調(diào)節(jié)的新基因；6，體外誘導胚胎干細胞〔誘導多能干細胞〕產(chǎn)生具有精子分化表型的精原細胞，并通過小鼠曲細精管注射實驗，檢測體外誘導分化所得精原細胞形成克隆的能力，通過體外受精和胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測其衍生細胞的受精和支持胚胎發(fā)育的能力。7，構(gòu)建35個第一和第二課題篩選得到的重要基因敲除載體〔第二批〕；8，初步完成小鼠模型的表型分析，找到這些基因可能調(diào)控的信號途徑；9，說明新發(fā)現(xiàn)的生長因子和激素等細胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控PGC分化的分子機理，進一步優(yōu)化培養(yǎng)體系；10，探明不同來源的牛ES細胞分子生物學方面的差異，為其體外誘導分化做準備。11，初步建立牛ES細胞體外定向誘導分化形成具有功能性配子〔精子、卵子〕的技術(shù)體系。利用卵母細胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法驗證誘導分化的生殖細胞的能力。12，撰寫論文810篇，申請專利12項。第四年：1， 利用四環(huán)素調(diào)節(jié)表達系統(tǒng), RNAi, ChIP等技術(shù)闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向PGC誘導過程中的作用與機理。2， 通過cDNA基因芯片篩選的方法系統(tǒng)分析胚胎干細胞〔誘導多能干細胞〕和精原干細胞的基因表達譜。從兩種細胞中別離出的RNA與小鼠的表達DNA陣列雜交，以檢測基因表達的上調(diào)或下降。3， 對視黃酸在生殖細胞中的受體及輔助受體復合物的形成及其中各成分的生物學功能的分子調(diào)節(jié)機制加以研究。4， 通過卵母細胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測體外誘導分化的生殖細胞是否可替代內(nèi)源精子細胞支持胚胎發(fā)育，產(chǎn)生后代。5， 建立特定基因過量表達或缺失的小鼠純合體模型, 并研究上述特定基因過量表達或缺失的胚胎干細胞及小鼠純合體的表型及對PGC及功能性配子形成的影響，探討關(guān)鍵基因〔如激素受體〕在小鼠PGC特化及減數(shù)分裂形成功能性配子過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。6， 利用上述人胚胎干細胞中創(chuàng)立PGC特化的報告基因體系及PGC生成的培養(yǎng)體系，優(yōu)化從人胚胎干細胞誘導分化PGC的條件，探討關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機理。7， 利用卵母細胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法對誘導分化的生殖細胞所形成的囊胚進行分子生物學、生理學分析及平安性檢測。并為其體內(nèi)發(fā)育做準備。8， 召開國際生殖學研討會。預期目標：1， 明確端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向PGC誘導過程中的作用機理。2， 完成胚胎干細胞〔誘導多能干細胞〕和精原干細胞的基因表達譜的檢測和比擬。3， 探索視黃酸在生殖細胞中的受體及輔助受體復合物的形成及其中各成分的生物學功能的分子調(diào)節(jié)機制。4， 體外誘導分化獲得生殖細胞，并通過卵母細胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代。5， 完成第一批小鼠模型的表型分析和機理研究。6， 初步完成重要基因在ESC特化為PGC體外功能和機理研究。7， 得到優(yōu)化的人ESC分化PGC的培養(yǎng)體系，初步說明細胞外因子的作用機理；8， 獲得以牛ES細胞誘導而來的生殖細胞體外所形成的囊胚，利用分子生物學手段驗證這些胚胎的生物活性，如甲基化、乙酰化以及端粒酶長短和活性等，并與正常體內(nèi)胚胎進行比擬，初步說明這種牛ES細胞誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎是否具有優(yōu)勢、是否具備平安性。9， 召開一次生殖學研討會。10， 撰寫論文810篇，申請專利13項。第五年：1， 利用以上的研究手法，與課題4共同篩選在誘導牛干細胞分化過程中的Nanog, Oct4，RAR/RXR的結(jié)合蛋白，檢索調(diào)控Blimp1 、Stella, PITX2, ckit、Stra8, vasa等基因表達的調(diào)控因子。明確組蛋白修飾及端粒蛋白和端粒酶的作用。2， 通過蛋白組學，別離，純化胚胎干細胞和精原干細胞的細胞膜成分，利用蛋白雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析，深入研究細胞外表蛋白表達的差異，綜合前四年研究結(jié)果分析胚胎干細胞和精原干細胞在DNA甲基化模式、基因表達和細胞外表蛋白成分的差異，說明造成精原干細胞和胚胎干細胞的不同發(fā)育潛力的主要原因。3， 綜合分析說明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細胞減數(shù)分裂的機制。4， 進一步研究體外誘導分化的生殖細胞通過胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得的后代的表型及生理功能，評估體外誘導分化獲得的生殖細胞對其后代的影響。5， 研究特定基因過量表達或缺失的胚胎干細胞及小鼠純合體表型,并探討相關(guān)的體外分子機制實驗。6， 結(jié)合其他課題組的研究成果,利用已完善的PGC及功能性配子誘導體系,檢測新發(fā)現(xiàn)的重要基因(如Oct4,Nanog的相互作用分子等)的功能及分子作用機理。7， 牛ES細胞誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎體內(nèi)發(fā)育能力，并與體內(nèi)來源胚胎在體內(nèi)正常發(fā)育進行比擬研究。8， 總結(jié)研究結(jié)果，匯總數(shù)據(jù)，提交研究報告，撰寫論文。預期目標：1，在整體細胞水平上初步確立干細胞向生殖細胞分化的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。2，完成胚胎干細胞〔誘導多能干細胞〕和精原干細胞外表蛋白表達的檢測和比擬；綜合前四年研究結(jié)果，說明造成精原干細胞和胚胎干細胞的不同發(fā)育潛力的主要原因；綜合分析說明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細胞減數(shù)分裂的機制；完成對卵母細胞胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)獲得后代的表型分析。3，完成第二批小鼠動物模型表型分析和機理研究；4，重要基因在ESC特化為PGC體外功能和機理研究；5，將牛ES細胞誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎移植于同期誘導發(fā)情的母體內(nèi)，力爭獲得后代。6， 比擬分析兩種胚胎生成后代牛的異同，初步說明以牛ES細胞誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎是否具備可行性和優(yōu)越性。以期真正意義上建立牛ES細胞體外誘導分化功能性生殖細胞的技術(shù)平臺，為經(jīng)濟動物的改進效勞。7， 整理論文810篇，申請專利35項。內(nèi)容總結(jié)
〔1〕一、研究內(nèi)容
本工程將以胚胎干細胞及誘導多能干細胞〔iPS〕為技術(shù)平臺，研究哺乳動物干細胞向生殖細胞分化以及生殖細胞減數(shù)分裂的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和機理，并建立研究生殖細胞分化所需的生物技術(shù)平臺及多種細胞及小鼠模型，從而提高干細胞向生殖細胞誘導分化的效率，為大型經(jīng)濟動物優(yōu)質(zhì)培育奠定根底