【正文】 生殖細(xì)胞分化機(jī)理產(chǎn)生功能性配子與克隆動(dòng)物建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾在PGC形成中的功能與調(diào)控機(jī)制闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向PGC誘導(dǎo)過程中的作用與機(jī) 理探索誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞的生物學(xué)功能及其對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響比擬ESC和SSC DNA甲基化模式、基因表達(dá)和細(xì)胞外表蛋白成分的差 異檢索RA信號(hào)調(diào)控的靶基因,分析減數(shù)分裂的機(jī) 理探討在誘導(dǎo)牛干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過程中信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)課題3. 誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化的體系及機(jī)理研究?jī)?yōu)化促進(jìn)PGC形成的最正確體外培養(yǎng)條 件探討關(guān)鍵基因在小鼠PGC特化過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式創(chuàng)立表達(dá)標(biāo)志PGC特化的報(bào)告基因體 系，探討關(guān)鍵信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī) 理課題4. 干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物培育上的應(yīng)用建立適宜的牛ESC體外培養(yǎng)體系利用創(chuàng)立的牛ESC體系，探討牛干細(xì)胞自我更新和分化的途徑誘導(dǎo)牛ESC分化為雄性生殖細(xì)胞建立以ESC體外誘導(dǎo)分化為功能性生殖細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)課題1，干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過程中重要蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析研究目標(biāo)：建立和完善高通量研究蛋白互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)以及干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的技術(shù)平臺(tái)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)，BiFC組學(xué)平臺(tái), 基因組學(xué)平臺(tái)，生物信息學(xué)平臺(tái)。從表觀遺傳學(xué)著手，研究PGC誘導(dǎo)過程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過程和不同修飾與PGC或精子發(fā)育之間的相互關(guān)系，以全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾〔著重于組蛋白?；?、甲基化的研究〕在PGC形成中的功能與調(diào)控機(jī)制。研究?jī)?nèi)容：1， 利用測(cè)序的方法〔如CpG二核苷酸位點(diǎn)上的甲基化〕，cDNA基因芯片的篩選，蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜分析技術(shù)，系統(tǒng)地比擬胚胎干細(xì)胞和精原干細(xì)胞DNA甲基化模式、基因表達(dá)和細(xì)胞外表蛋白成分的差異。課題承當(dāng)單位：中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院課題負(fù)責(zé)人： 楊東山 副研究員〔中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院〕主要學(xué)術(shù)骨干：戚華宇 研究員 〔中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院〕 謝 亭 教授 〔中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院〕 徐仁和 教授 〔中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院〕課題經(jīng)費(fèi)比例：占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的23%。 3， 在人胚胎干細(xì)胞中創(chuàng)立穩(wěn)定表達(dá)標(biāo)志PGC特化的報(bào)告基因體系 (Blimp1GFP和StellaGFP等)，以有效地監(jiān)測(cè)PGC的形成，并利用此體系，優(yōu)化從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化PGC的條件，探討關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)理。4， 以其它子課題的蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等相關(guān)研究為根底，利用創(chuàng)立的牛ES細(xì)胞體系，探討牛干細(xì)胞自我更新和分化的途徑。2，檢測(cè)不同生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)作用,并嘗試體外誘導(dǎo)PGC減數(shù)分裂形成功能性配子。6，建立特定基因過量表達(dá)或缺失的轉(zhuǎn)基因及基因敲除載體。2， 別離獲得小鼠精原干細(xì)胞；初步完成精子前體細(xì)胞中生物信息學(xué)分析，確定23個(gè)受視黃酸誘導(dǎo)調(diào)控并參與減數(shù)分裂調(diào)控的目標(biāo)基因。6， 構(gòu)建小鼠配子中特異表達(dá)的Gpr126等35個(gè)重要基因的條件敲除載體或轉(zhuǎn)基因載體。10， 撰寫論文12篇。4， 利用測(cè)序的方法〔如CpG二核苷酸位點(diǎn)上的甲基化〕分析精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的基因組DNA，印跡基因和一些關(guān)鍵的多能性基因的DNA甲基化模式。6， 建立去除內(nèi)源精原干細(xì)胞的野生型小鼠或缺失精原干細(xì)胞的突變型小鼠，用于曲細(xì)精管注射檢測(cè)體外培養(yǎng)的精原干細(xì)胞的生物學(xué)功能。9， 在優(yōu)化的體外培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)ESC向PGC分化，運(yùn)用基因芯片和定量PCR等技術(shù)篩選PGC特異的基因〔主要是GPCR和其他受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)分子〕并研究其表達(dá)模式。13， 探索已建立的牛胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)條件可否適合體外來源的牛胚胎〔體外受精胚胎和體外克隆胚胎〕的可行性。3， 完成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的DNA甲基化測(cè)序。7， 在無血清培養(yǎng)條件下，建立ESC向PGC分化的最正確體外培養(yǎng)體系。11， 建立特定基因過表達(dá)和knockdown的ES細(xì)胞株，得到嵌合體小鼠〔第一批〕。15， 與其他子課題的蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等相關(guān)研究為根底，初步說明LIFSTAT3等信號(hào)通路在維持ES細(xì)胞自我更新中的作用。3， 全面篩選與組蛋白修飾相關(guān)的基因，通過基因敲除或過量表達(dá)，驗(yàn)證不同修飾與PGC或精子發(fā)育之間的相互關(guān)系，以全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾〔著重于組蛋白?；?、甲基化的研究〕在PGC形成中的功能與調(diào)控機(jī)制。6， 根據(jù)精原干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞差異分析的初步結(jié)果，在的實(shí)驗(yàn)條件根底上改進(jìn)，以期找出胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)精子細(xì)胞的更有效方法。11， 已建立的不同胚胎來源〔體內(nèi)胚胎、體外受精胚胎和克隆胚胎〕的牛ES細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)分析。3，揭示組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過程和不同修飾與PGC發(fā)育之間的相互關(guān)系。利用卵母細(xì)胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法驗(yàn)證誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞的能力。從兩種細(xì)胞中別離出的RNA與小鼠的表達(dá)DNA陣列雜交，以檢測(cè)基因表達(dá)的上調(diào)或下降。6， 利用上述人胚胎干細(xì)胞中創(chuàng)立PGC特化的報(bào)告基因體系及PGC生成的培養(yǎng)體系，優(yōu)化從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化PGC的條件，探討關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)理。預(yù)期目標(biāo)：1， 明確端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向PGC誘導(dǎo)過程中的作用機(jī)理。5， 完成第一批小鼠模型的表型分析和機(jī)理研究。10， 撰寫論文810篇，申請(qǐng)專利13項(xiàng)。3， 綜合分析說明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的機(jī)制。7， 牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的生殖細(xì)胞所形成的胚胎體內(nèi)發(fā)育能力，并與體內(nèi)來源胚胎在體內(nèi)正常發(fā)育進(jìn)行比擬研究。3，完成第二批小鼠動(dòng)物模型表型分析和機(jī)理研究；4，重要基因在ESC特化為PGC體外功能和機(jī)理研究；5，將牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的生殖細(xì)胞所形成的胚胎移植于同期誘導(dǎo)發(fā)情的母體內(nèi)，力爭(zhēng)獲得后代。內(nèi)容總結(jié)
〔1〕一、研究?jī)?nèi)容
本工程將以胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞〔iPS〕為技術(shù)平臺(tái)，研究哺乳動(dòng)物干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化以及生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和機(jī)理，并建立研究生殖細(xì)胞分化所需的生物技術(shù)平臺(tái)及多種細(xì)胞及小鼠模型，從而提高干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率，為大型經(jīng)濟(jì)動(dòng)物優(yōu)質(zhì)培育奠定根底