【正文】 員積累了大量的關(guān)鍵性研究材料，如各種ES細(xì)胞系，iPS細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因鼠，牛等，可為本工程的實(shí)施提供強(qiáng)有力的保證。 3，可行性分析本工程的總體方案是切實(shí)可行的。2，技術(shù)途徑根據(jù)以上的學(xué)術(shù)思路，本工程的總體研究技術(shù)途徑如圖2所示。12，申請(qǐng)創(chuàng)造專利10項(xiàng)以上。9，在國(guó)際重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表高水平論文40篇以上。5，說(shuō)明雄性生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂的分子機(jī)制。五年預(yù)期目標(biāo)1，開(kāi)展基于干細(xì)胞學(xué)和生殖細(xì)胞學(xué)研究的一整套方法和綜合技術(shù)平臺(tái)。二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)本工程以研究誘導(dǎo)分化技術(shù)、蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、減數(shù)分裂機(jī)理及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物培育為主線，緊密?chē)@以上3個(gè)擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。說(shuō)明雄性生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂的分子機(jī)制，建立干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化雄性生殖細(xì)胞的理論體系，并分析體外生成生殖細(xì)胞的生物學(xué)功能。〔1〕利用蛋白質(zhì)組學(xué)，BiFC組學(xué), 信息學(xué)研究平臺(tái)，建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選控制PGC基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，并闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向PGC誘導(dǎo)分化過(guò)程中的作用機(jī)理。同時(shí)利用表觀遺傳學(xué)研究技術(shù)，分析PGC誘導(dǎo)過(guò)程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)過(guò)程和不同修飾與PGC發(fā)育之間的相互關(guān)系。(3)以人及小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化系統(tǒng)為模型，優(yōu)化PGC特化的條件，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因及基因敲除的方法，探索關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在PGC形成過(guò)程中的功能及調(diào)控機(jī)理。在建立的多種技術(shù)平臺(tái)的根底上，確立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選控制PGC基因表達(dá)的關(guān)鍵因子。2，建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的較為完整的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出控制PGC基因表達(dá)的幾個(gè)關(guān)鍵因子。6，建立一整套誘導(dǎo)PGC生成的培養(yǎng)體系。其中影響因子大于10的論文8篇以上。三、研究方案1，總體思路干細(xì)胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能。具體地，本工程將首先建立能夠系統(tǒng)挖掘生殖細(xì)胞靶蛋白及其體外誘導(dǎo)分化的技術(shù)手段與平臺(tái)，包括：蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)、蛋白質(zhì)BiFC表達(dá)庫(kù)和RNAi庫(kù)、生物信息學(xué)技術(shù)平臺(tái)和動(dòng)物模型技術(shù)平臺(tái)。首先，本工程提出的主要科學(xué)問(wèn)題和研究目標(biāo)不僅具有理論和實(shí)際依據(jù)，而且都是該領(lǐng)域前沿性和關(guān)鍵性的問(wèn)題。其次，工程承當(dāng)單位具有良好的研究條件和根底，并且已經(jīng)具備了相當(dāng)?shù)囊?guī)模、取得了很好的科研成果。其三，承當(dāng)本工程研究工作的中堅(jiān)力量和學(xué)術(shù)骨干多數(shù)是新近從海外留學(xué)工作歸國(guó)的成績(jī)卓著的中青年科學(xué)家，擁有豐富的研究成果和研究經(jīng)驗(yàn)，屢次在國(guó)際著名專業(yè)雜志上發(fā)表論文。工程中的四個(gè)子課題既相互獨(dú)立，又交叉互補(bǔ)。將根底科學(xué)與實(shí)際應(yīng)用相結(jié)合，力爭(zhēng)在解答根底科學(xué)問(wèn)題的同時(shí)，開(kāi)展新的動(dòng)物繁殖技能。這些可為人類提供高品質(zhì)食源，具有非常明顯的創(chuàng)新性。工程規(guī)劃管理和運(yùn)作體制包括總工程和子課題兩個(gè)層次。(2) 在研究方面，不只停留在單項(xiàng)技術(shù)或研究手段上，而是開(kāi)展綜合技術(shù)平臺(tái)及多種細(xì)胞和動(dòng)物模型。本工程的執(zhí)行采用首席科學(xué)家負(fù)責(zé)制。本工程期望在誘導(dǎo)干細(xì)胞生成生殖細(xì)胞關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題上取得重大突破性成果，保證按期完成工程的總體目標(biāo)和五年目標(biāo)。2, 以Blimp1 、Stella, PITX2, ckit、Stra8, vasa和DAZL等重要的PGC表達(dá)基因?yàn)槟Ｊ剑?從PGC或生殖母細(xì)胞調(diào)控元及與其相互作用的蛋白質(zhì)組中篩選出控制這些基因表達(dá)的關(guān)鍵因子。課題承當(dāng)單位： 中山大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 松陽(yáng)洲 教授 〔中山大學(xué)〕主要學(xué)術(shù)骨干： 張 雁 教授 〔中山大學(xué)〕項(xiàng) 鵬 教授 〔中山大學(xué)〕 周天壽 教授 〔中山大學(xué)〕 張勤奮 副教授 〔中山大學(xué)〕王繼剛 講師 〔華東師范大學(xué)〕李鯤鵬 講師 〔中山大學(xué)〕課題經(jīng)費(fèi)比例： 占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的31% 課題2，雄性生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)理研究研究目標(biāo)：通過(guò)對(duì)精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的表觀遺傳，基因表達(dá)和外表蛋白差異的系統(tǒng)分析，對(duì)視黃素(RA)信號(hào)通路及其在精子生成細(xì)胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂功能的特異性分析，闡述精原干細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制，為干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化雄性生殖細(xì)胞提供依據(jù)。3．利用全細(xì)胞成像及分子生物學(xué)技術(shù)分析誘導(dǎo)分化的雄性生殖細(xì)胞，通過(guò)小鼠曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞注射和卵細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射，探索體外誘導(dǎo)分化的生殖細(xì)胞的生物學(xué)功能及其對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響。2， 利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)，建立特定基因過(guò)量表達(dá)或缺失的胚胎干細(xì)胞株及小鼠模型，探討關(guān)鍵基因〔如激素受體及BMP家族〕在小鼠PGC特化過(guò)程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。研究?jī)?nèi)容：1，參照人和動(dòng)物ES細(xì)胞建系的技術(shù)，選用不同胚齡及各種附植前牛胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，建立適宜的牛ES細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。課題承當(dāng)單位： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 朱 捷 教授 〔中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)〕主要學(xué)術(shù)骨干： 陳瑤生 教授 〔中山大學(xué)〕周光斌 副教授 〔中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)〕 于政權(quán) 副教授 〔中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)〕課題經(jīng)費(fèi)比例 占申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的23%四、年度方案第一年：1, 建立較為理想的從小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)PGC形成的培養(yǎng)體系。5，開(kāi)展小鼠曲細(xì)精管注射及卵母細(xì)胞胞漿注射實(shí)驗(yàn)，建立精原干細(xì)胞和精子細(xì)胞的功能檢測(cè)體系，以便于對(duì)體外誘導(dǎo)分化所得精原〔精子〕細(xì)胞的生物學(xué)功能加以驗(yàn)證。預(yù)期目標(biāo)：1， 建立和完善高通量研究蛋白互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)平臺(tái)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)，BiFC組學(xué)平臺(tái), 基因組學(xué)平臺(tái)，生物信息學(xué)平臺(tái)。5， 成功誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化成為PGC，檢測(cè)RA、BMP等5種以上信號(hào)分子對(duì)PGC分化的影響。9， 建立牛胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。3， 利用生物信息學(xué)研究手法，建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。設(shè)計(jì)、構(gòu)建相關(guān)載體、DNA文庫(kù)，用以篩選與視黃素受體相互作用的蛋白。8， 以gonadal細(xì)胞共培養(yǎng)的方式建立適合PGC生長(zhǎng)及減數(shù)分裂形成功能性配子的微環(huán)境。12， 進(jìn)一步探索已建立的牛類胚干細(xì)胞系體外分化為三個(gè)胚層的能力及種系嵌合的研究。2， 建立以PGC關(guān)鍵調(diào)控元為中心的較為完整的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。6， 獲得去除內(nèi)源精原干細(xì)胞的野生型小鼠或缺失精原干細(xì)胞的突變型小鼠，獲得精子注射小鼠后