【正文】 7， 牛ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的生殖細(xì)胞所形成的胚胎體內(nèi)發(fā)育能力，并與體內(nèi)來源胚胎在體內(nèi)正常發(fā)育進(jìn)行比擬研究。預(yù)期目標(biāo)：1， 明確端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向PGC誘導(dǎo)過程中的作用機(jī)理。3，揭示組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與PGC發(fā)育之間的相互關(guān)系。15， 與其他子課題的蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等相關(guān)研究為根底，初步說明LIFSTAT3等信號通路在維持ES細(xì)胞自我更新中的作用。13， 探索已建立的牛胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)條件可否適合體外來源的牛胚胎〔體外受精胚胎和體外克隆胚胎〕的可行性。10， 撰寫論文12篇。2，檢測不同生長因子的誘導(dǎo)作用,并嘗試體外誘導(dǎo)PGC減數(shù)分裂形成功能性配子。研究內(nèi)容：1， 利用測序的方法〔如CpG二核苷酸位點(diǎn)上的甲基化〕，cDNA基因芯片的篩選，蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜分析技術(shù)，系統(tǒng)地比擬胚胎干細(xì)胞和精原干細(xì)胞DNA甲基化模式、基因表達(dá)和細(xì)胞外表蛋白成分的差異。為此，本工程將以系統(tǒng)性運(yùn)作方式為主。這些課題既是有關(guān)研究人員各自多年工作的合理延伸和拓展，又集中了優(yōu)勢力量，對誘導(dǎo)干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化中的核心問題進(jìn)行多側(cè)面的合作研究。通過這些平臺，系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)與生殖細(xì)胞分化相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步利用現(xiàn)代分子生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)確定一些蛋白質(zhì)的靶蛋白網(wǎng)絡(luò)和功能以及調(diào)控機(jī)理。3，明確端粒蛋白以及端粒酶在干細(xì)胞向PGC誘導(dǎo)過程中的作用機(jī)理，并揭示組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與PGC發(fā)育之間的相互關(guān)系。工程名稱：干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的調(diào)控機(jī)理及應(yīng)用性研究首席科學(xué)家：松陽洲 中山大學(xué)起止年限：2022年1月2021年8月依托部門：教育部一、研究內(nèi)容本工程將以胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞〔iPS〕為技術(shù)平臺，研究哺乳動物干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化以及生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和機(jī)理，并建立研究生殖細(xì)胞分化所需的生物技術(shù)平臺及多種細(xì)胞及小鼠模型，從而提高干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率，為大型經(jīng)濟(jì)動物優(yōu)質(zhì)培育奠定根底。4，明確精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞之間的基因表達(dá)差異，確定36個差異表達(dá)基因。在這些根底研究的根底上，進(jìn)一步以小鼠和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動物為研究對象，應(yīng)用干細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的生殖細(xì)胞來培育優(yōu)化動物。此題目的創(chuàng)新性主要表達(dá)在：(1)本工程探討的問題是國際前沿的科學(xué)問題，因此保證了工程的創(chuàng)新性。不但充分發(fā)揮子課題各承當(dāng)單位的技術(shù)和學(xué)科優(yōu)勢，而且加強(qiáng)優(yōu)勢力量的整合和協(xié)同攻關(guān)，發(fā)揚(yáng)團(tuán)隊(duì)精神，形成科研功能配套、統(tǒng)籌合理、機(jī)動靈活且充滿活力的科研體系。2，通過生物信息學(xué)技術(shù)，利用RAR/RXR在DNA結(jié)合區(qū)域的序列保守性，檢索精子前體細(xì)胞中RA信號調(diào)控的靶基因。3，利用蛋白質(zhì)組學(xué)及BiFC組學(xué)研究技術(shù), 系統(tǒng)地從human ORFeome (12000 個基因) 或其他逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)庫中篩選直接與Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad相互作用的蛋白。第二年：1， 在前年度研究結(jié)果的根底上，繼續(xù)完善體外胚胎干細(xì)胞〔誘導(dǎo)多能干細(xì)胞〕誘導(dǎo)分化精子細(xì)胞的有效途徑，利用精原干細(xì)胞的標(biāo)志基因以及帶有精子前體細(xì)胞熒光標(biāo)記蛋白的小鼠對體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞加以檢驗(yàn)。14， 利用創(chuàng)立的牛ES細(xì)胞體系，初步探討牛ES細(xì)胞自我更新和分化途徑。16， 撰寫論文68篇，申請專利1項(xiàng)。4，完成精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞〔誘導(dǎo)多能干細(xì)胞〕組蛋白修飾模式的檢測和比擬；5，完成生物信息學(xué)分析結(jié)果確定的相關(guān)基因?qū)?xì)胞減數(shù)分裂的影響研究，初步完成相關(guān)載體、DNA文庫的構(gòu)建，篩選與視黃素受體相互作用的蛋白，確定12個參與減數(shù)分裂調(diào)節(jié)的新基因；6，體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞〔誘導(dǎo)多能干細(xì)胞〕產(chǎn)生具有精子分化表型的精原細(xì)胞，并通過小鼠曲細(xì)精管注射實(shí)驗(yàn)，檢測體外誘導(dǎo)分化所得精原細(xì)胞形成克隆的能力，通過體外受精和胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)檢測其衍生細(xì)胞的受精和支持胚胎發(fā)育的能力。2， 完成胚胎干細(xì)胞〔誘導(dǎo)多能干細(xì)胞〕和精原干細(xì)胞的基因表達(dá)譜的檢測和比擬。8， 總結(jié)研究結(jié)果，匯總數(shù)據(jù)，提交研究報(bào)告，撰寫論文。6， 結(jié)合其他課題組的研究成果,利用已完善的PGC及功能性配子誘導(dǎo)體系,檢測新發(fā)現(xiàn)的重要基因(如Oct4,Nanog的相互作用分子等)的功能及分子作用機(jī)理。8， 召開國際生殖學(xué)研討會。2，發(fā)現(xiàn)假設(shè)干個新的調(diào)控干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾因子。14， 建立13個具備生殖嵌合能力的牛胚胎干細(xì)胞系。12， 進(jìn)一步探索已建立的牛類胚干細(xì)胞系體外分化為三個胚層的能力及種系嵌合的研究。9， 建立牛胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。課題承當(dāng)單位： 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 朱 捷 教授 〔中國農(nóng)業(yè)大學(xué)〕主要學(xué)術(shù)骨干： 陳瑤生 教授 〔中山大學(xué)〕周光斌 副教授 〔中國農(nóng)業(yè)大學(xué)〕 于政權(quán) 副教授 〔中國農(nóng)業(yè)大學(xué)〕課題經(jīng)費(fèi)比例 占申請經(jīng)費(fèi)的23%四、年度方案第一年：1, 建立較為理想的從小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)PGC形成的培養(yǎng)體系。課題承當(dāng)單位： 中山大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 松陽洲 教授 〔中山大學(xué)〕主要學(xué)術(shù)骨干： 張 雁 教授 〔中山大學(xué)〕項(xiàng) 鵬 教授 〔中山大學(xué)〕 周天壽 教授 〔中山大學(xué)〕 張勤奮 副教授 〔中山大學(xué)〕王繼剛 講師 〔華東師范大學(xué)〕李鯤鵬 講師 〔中山大學(xué)〕課題經(jīng)費(fèi)比例： 占申請經(jīng)費(fèi)的31% 課題2，雄性生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)理研究研究目標(biāo)：通過對精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的表觀遺傳，基因表達(dá)和外表蛋白差異的系統(tǒng)分析，對視黃素(RA)信號通路及其在精子生成細(xì)胞中誘導(dǎo)減數(shù)分裂功能的特異性分析，闡述精原干細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制，為干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化雄性生殖細(xì)胞提供依據(jù)。(2) 在研究方面，不只停留在單項(xiàng)技術(shù)或研究手段上，而是開展綜合技術(shù)平臺及多種細(xì)胞和動物模型。工程中的四個子課題既相互獨(dú)立，又交叉互補(bǔ)。具體地，本工程將首先建立能夠系統(tǒng)挖掘生殖細(xì)胞靶蛋白及其體外誘導(dǎo)分化的技術(shù)手段與平臺，包括：蛋白質(zhì)組學(xué)平臺、蛋白質(zhì)BiFC表達(dá)庫和RNAi庫、生物信息學(xué)技術(shù)平臺和動物模型