【正文】 7， 牛ES細胞誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎體內發(fā)育能力，并與體內來源胚胎在體內正常發(fā)育進行比擬研究。預期目標：1， 明確端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向PGC誘導過程中的作用機理。3，揭示組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與PGC發(fā)育之間的相互關系。15， 與其他子課題的蛋白網絡調控等相關研究為根底，初步說明LIFSTAT3等信號通路在維持ES細胞自我更新中的作用。13， 探索已建立的牛胚胎干細胞體外培養(yǎng)條件可否適合體外來源的牛胚胎〔體外受精胚胎和體外克隆胚胎〕的可行性。10， 撰寫論文12篇。2，檢測不同生長因子的誘導作用,并嘗試體外誘導PGC減數分裂形成功能性配子。研究內容：1， 利用測序的方法〔如CpG二核苷酸位點上的甲基化〕，cDNA基因芯片的篩選，蛋白質組學和質譜分析技術，系統(tǒng)地比擬胚胎干細胞和精原干細胞DNA甲基化模式、基因表達和細胞外表蛋白成分的差異。為此，本工程將以系統(tǒng)性運作方式為主。這些課題既是有關研究人員各自多年工作的合理延伸和拓展，又集中了優(yōu)勢力量，對誘導干細胞向生殖細胞分化中的核心問題進行多側面的合作研究。通過這些平臺，系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)與生殖細胞分化相關的調控網絡，并進一步利用現(xiàn)代分子生物學、細胞培養(yǎng)等技術確定一些蛋白質的靶蛋白網絡和功能以及調控機理。3，明確端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向PGC誘導過程中的作用機理，并揭示組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與PGC發(fā)育之間的相互關系。工程名稱：干細胞向生殖細胞誘導分化的調控機理及應用性研究首席科學家：松陽洲 中山大學起止年限：2022年1月2021年8月依托部門：教育部一、研究內容本工程將以胚胎干細胞及誘導多能干細胞〔iPS〕為技術平臺，研究哺乳動物干細胞向生殖細胞分化以及生殖細胞減數分裂的調控網絡和機理，并建立研究生殖細胞分化所需的生物技術平臺及多種細胞及小鼠模型，從而提高干細胞向生殖細胞誘導分化的效率，為大型經濟動物優(yōu)質培育奠定根底。4，明確精原干細胞和胚胎干細胞之間的基因表達差異，確定36個差異表達基因。在這些根底研究的根底上，進一步以小鼠和農業(yè)經濟動物為研究對象，應用干細胞誘導產生的生殖細胞來培育優(yōu)化動物。此題目的創(chuàng)新性主要表達在：(1)本工程探討的問題是國際前沿的科學問題，因此保證了工程的創(chuàng)新性。不但充分發(fā)揮子課題各承當單位的技術和學科優(yōu)勢，而且加強優(yōu)勢力量的整合和協(xié)同攻關，發(fā)揚團隊精神，形成科研功能配套、統(tǒng)籌合理、機動靈活且充滿活力的科研體系。2，通過生物信息學技術，利用RAR/RXR在DNA結合區(qū)域的序列保守性，檢索精子前體細胞中RA信號調控的靶基因。3，利用蛋白質組學及BiFC組學研究技術, 系統(tǒng)地從human ORFeome (12000 個基因) 或其他逆轉錄病毒表達庫中篩選直接與Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad相互作用的蛋白。第二年：1， 在前年度研究結果的根底上，繼續(xù)完善體外胚胎干細胞〔誘導多能干細胞〕誘導分化精子細胞的有效途徑，利用精原干細胞的標志基因以及帶有精子前體細胞熒光標記蛋白的小鼠對體外誘導產生的細胞加以檢驗。14， 利用創(chuàng)立的牛ES細胞體系，初步探討牛ES細胞自我更新和分化途徑。16， 撰寫論文68篇，申請專利1項。4，完成精原干細胞和胚胎干細胞〔誘導多能干細胞〕組蛋白修飾模式的檢測和比擬；5，完成生物信息學分析結果確定的相關基因對精原細胞減數分裂的影響研究，初步完成相關載體、DNA文庫的構建，篩選與視黃素受體相互作用的蛋白，確定12個參與減數分裂調節(jié)的新基因；6，體外誘導胚胎干細胞〔誘導多能干細胞〕產生具有精子分化表型的精原細胞，并通過小鼠曲細精管注射實驗，檢測體外誘導分化所得精原細胞形成克隆的能力，通過體外受精和胞漿內精子注射技術檢測其衍生細胞的受精和支持胚胎發(fā)育的能力。2， 完成胚胎干細胞〔誘導多能干細胞〕和精原干細胞的基因表達譜的檢測和比擬。8， 總結研究結果，匯總數據，提交研究報告，撰寫論文。6， 結合其他課題組的研究成果,利用已完善的PGC及功能性配子誘導體系,檢測新發(fā)現(xiàn)的重要基因(如Oct4,Nanog的相互作用分子等)的功能及分子作用機理。8， 召開國際生殖學研討會。2，發(fā)現(xiàn)假設干個新的調控干細胞向生殖細胞分化的關鍵轉錄因子和染色質修飾因子。14， 建立13個具備生殖嵌合能力的牛胚胎干細胞系。12， 進一步探索已建立的牛類胚干細胞系體外分化為三個胚層的能力及種系嵌合的研究。9， 建立牛胚胎干細胞體外培養(yǎng)體系。課題承當單位： 中國農業(yè)大學課題負責人： 朱 捷 教授 〔中國農業(yè)大學〕主要學術骨干： 陳瑤生 教授 〔中山大學〕周光斌 副教授 〔中國農業(yè)大學〕 于政權 副教授 〔中國農業(yè)大學〕課題經費比例 占申請經費的23%四、年度方案第一年：1, 建立較為理想的從小鼠胚胎干細胞誘導PGC形成的培養(yǎng)體系。課題承當單位： 中山大學 課題負責人： 松陽洲 教授 〔中山大學〕主要學術骨干： 張 雁 教授 〔中山大學〕項 鵬 教授 〔中山大學〕 周天壽 教授 〔中山大學〕 張勤奮 副教授 〔中山大學〕王繼剛 講師 〔華東師范大學〕李鯤鵬 講師 〔中山大學〕課題經費比例： 占申請經費的31% 課題2，雄性生殖細胞體外誘導分化的基因表達及調控機理研究研究目標：通過對精原干細胞和胚胎干細胞的表觀遺傳，基因表達和外表蛋白差異的系統(tǒng)分析，對視黃素(RA)信號通路及其在精子生成細胞中誘導減數分裂功能的特異性分析，闡述精原干細胞分化的調控機制，為干細胞體外誘導分化雄性生殖細胞提供依據。(2) 在研究方面，不只停留在單項技術或研究手段上，而是開展綜合技術平臺及多種細胞和動物模型。工程中的四個子課題既相互獨立，又交叉互補。具體地，本工程將首先建立能夠系統(tǒng)挖掘生殖細胞靶蛋白及其體外誘導分化的技術手段與平臺，包括：蛋白質組學平臺、蛋白質BiFC表達庫和RNAi庫、生物信息學技術平臺和動物模型