【正文】 X V VII IX VIII 野生型 M13RFDNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13mp系列載體 lacZ‘ polylinker 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 M13單鏈?zhǔn)删w DNA M13 DNA載體的特點(diǎn)： 使克隆的 DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外 這在 DNA定向突變中非常有用 M13重組分子篩選簡便 被 M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成混 濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁 斑的混濁度亦越大 但 M13DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有 kb 噬菌體或病毒 DNA 與動植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動植物的病 毒基因組 DNA。 動植物病毒種類繁多，每一種動植物都有多種特異性的病 毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動植物病毒分成四大類： 單鏈 DNA病毒 雙鏈 DNA病毒 單鏈 RNA病毒 雙鏈 RNA病毒 RNA病毒在自我復(fù)制時大多存在相應(yīng)的 DNA中間反應(yīng)物， 這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的 DNA重組。 考斯質(zhì)粒與噬菌粒 lDNA載體和 M13DNA載體的裝載量最大分別為 25 kb和 kb， 但在很多情況下，往往需要 克隆更大的外源 DNA片段， 考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體 DNA 的裝載量。 在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體 DNA的長度， 就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體 DNA與包裝有關(guān)的序 列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時 又能保證重組 DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這 便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒 和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組 DNA分子在細(xì)胞內(nèi) 不能形成噬菌體顆粒。 考斯質(zhì)粒與噬菌粒 考斯質(zhì)粒（ cosmid） 考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建： 考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有 1978年 Collins和 Hohn發(fā)明構(gòu)建 pHC79 6400 bp Tcr l fragment cos ori Apr PstI BamHI SalI lDNA cos序列和 質(zhì)粒復(fù)制子的 特殊類型的載體 cos site carrying plasmid kb的 lDNA片段 + pBR322片段 裝載范圍為 31 45 kb 考斯質(zhì)粒與噬菌粒 考斯質(zhì)粒（ cosmid） 考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)： 能像 lDNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量大（ 45 kb） 且克隆片段具有一定的大小范圍 能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞 中自主復(fù)制 重組操作簡便，篩選容易 不能體內(nèi)包裝，不裂解 受體細(xì)胞 考斯質(zhì)粒與噬菌粒 噬菌粒（ phagemid or phasmid） 噬菌粒載體的特點(diǎn)： 噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w 包裝序列、復(fù)制子 以及 質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體 能像 M13DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量比常規(guī)的 M13mp系列要大很多（ 10 kb） 能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞 中自主復(fù)制 重組操作簡便，篩選容易 通過克隆雙鏈 DNA能獲得同等長度的單一單鏈 DNA 考斯質(zhì)粒與噬菌粒 噬菌粒（ phagemid or phasmid） 重要的噬菌粒載體： pUC118 / 119 pUC118 pUC18 + M13間隔區(qū) IG pUC119 pUC19 + M13間隔區(qū) IG 500 個拷貝 3200 bp MCS lacZ’ lacI ori Apr M13MG pUC118 / 119 表示 M13輔助噬菌體 DNA 考斯質(zhì)粒與噬菌粒 噬菌粒（ phagemid or phasmid） 重要的噬菌粒載體： pBluescript 體外轉(zhuǎn)錄載體 pBluescript = pUC + f1ori + PT3 + PT7 2958 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr f1ori pBluescript PT3 噬菌體啟動子 PT3和 PT7強(qiáng)化外 源基因的轉(zhuǎn)錄 提取出來的單鏈 DNA重組分子 在噬菌體 RNA聚合酶的存 在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因 的體外轉(zhuǎn)錄 人造染色體載體 人類、動物、植物的全基因組序列分析往往 需要 克隆數(shù)百 甚至上千 kb 的 DNA片段， 此時考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載 量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。 將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn) 定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外 源 DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體， 它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。 目前常用的人造染色體載體包括： 細(xì)菌人造染色體（ BAC） 酵母人造染色體（ YAC） 人造染色體載體 細(xì)菌人造染色體（ Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子 F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上 構(gòu)建的，其裝載量范圍在 50 300 kb之間 各種類型的 pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝 pBACs主要適用于： 克隆大型基因簇（ gene cluster） 結(jié)構(gòu) 構(gòu)建動植物基因文庫 人造染色體載體 酵母人造染色體（ Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC載體應(yīng)含有下列元件： 酵母染色體的端粒序列 酵母人造染色體的構(gòu)建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色體的復(fù)制子 酵母染色體的中心粒序列 酵母系統(tǒng)的 選擇標(biāo)記 大腸桿菌的復(fù)制子 大腸桿菌的 選擇標(biāo)記 YAC載體的裝載量為 350 400 kb 人造染色體載體 酵母人造染色體（ Yeast Artificial Chromosomes YAC） 酵母人造染色體的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 連接 轉(zhuǎn)化酵母菌 重組酵母染色體 C 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞 3 基因工程的基本條件 各種基因工程受體的特性 實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 限制性缺陷型 外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（ recB， recC， hsdR） 重組整合缺陷型 用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞 （ recA） 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型 感染寄生缺陷型 防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染，生物武器除外 各種基因工程受體的特性 大腸桿菌 遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長迅速，培養(yǎng)簡單，重組子穩(wěn)定 適用于外源 DNA的擴(kuò)增和克隆、原核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建，是 DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要受體菌 產(chǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素 各種基因工程受體的特性 枯草桿菌 遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全 ，生長迅速，培養(yǎng)簡單，不產(chǎn)內(nèi)毒素 適用于原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌 遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備 各種基因工程受體的特性 鏈霉菌 抗生素的主要生產(chǎn)者，分子遺傳相對操作簡便，不產(chǎn)內(nèi)毒素 主要用于抗生素生產(chǎn)菌株的改良 遺傳不穩(wěn)定，生長相對緩慢 各種基因工程受體的特性 酵母菌 具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定 適用于外源 DNA的擴(kuò)增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的研究，是 DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程重要的真核性受體菌 內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高 各種基因工程受體的特性 昆蟲細(xì)胞（家蠶） 具有真核生物的特征，外源基因表達(dá)量高，繁殖相對較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定 適用于真核生物基因的高效表達(dá) DNA重組操作系統(tǒng)欠完善 各種基因工程受體的特性 哺乳動物細(xì)胞（中國 倉鼠卵巢細(xì)胞 CHO） 與人的親緣關(guān)系近，分子重組表達(dá)系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng) 適用于哺乳類動物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是 DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要哺乳動物受體 細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長緩慢 各種基因工程受體的特性 植物細(xì)胞（擬南芥菜、煙葉 ） 農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)意義重大，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞易于分化，細(xì)胞培養(yǎng)簡單且成本低廉，具有光合作用 適用于高等植物基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因藥物的生產(chǎn)，農(nóng)作物品質(zhì)的改良 遺傳操作繁瑣 實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體 大腸桿菌 用于接受質(zhì)粒： C600、 W31 HB10 JM8 JM101（ Aps、 Tcs、 Cms） 用于接受 lDNA： LE39 ED8654 酵母菌 哺乳動物細(xì)胞 CHO 畢赤酵母 啤酒酵母 演講完畢，謝謝觀看！