生命科學與農(nóng)業(yè)-資料下載頁
2024-12-29 15:03本頁面
【正文】 法 : 多拷貝整合概率高 ， 外源基因默表達 。 農(nóng)桿菌介導 : 低拷貝整合 （ 多為單拷貝整合 ） 轉化效率較高 。 (2） 基因槍法 :純物理轉化 ， 不存在物種的限制 。 農(nóng)桿菌介導 :存在宿主范圍的局限性 。 （ 3） 基因槍法適于以細胞器為轉化目標的轉基因研究 。 三、 轉化子細胞的篩選 ? 當采用某種轉基因方法處理外植體后 ， 通常外植體中僅僅只有幾個少數(shù)細胞獲得轉化 ， 只有采取有效的轉化方法 ， 才能提高準確地選擇到轉化細胞 。 ? 一般情況下 ， 轉化載體上除了帶有目的基因外 ，大多還攜帶選擇基因 ， 以供轉化細胞篩選使用 。轉化篩選細胞的方法主要有兩種： 選擇基因的特點 ? 一是根據(jù)選擇基因的特點在篩選選擇培養(yǎng)基中加入能抑制非轉化細胞生長的有毒物質 . ? 如抗生素 、 除草劑等 ， 選擇基因通常為一種解毒基因 ， 可以解除培養(yǎng)基中有害物質對細胞生長的抑制作用 ， 這樣只有轉化細胞才能生長繁殖； ? 另一種方式是 ， 受體細胞為營養(yǎng)缺陷型細胞 ， 在選擇性培養(yǎng)基中不能生殖 ， 而選擇培養(yǎng)基可以補償這種缺陷 ， 使轉化細胞在選擇性培養(yǎng)基上正常生長 。 一、植物基因工程中的選擇基因 ? 植物基因工程中的基因主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因 。 ? 最常用的有： ? 新霉素抗性基因 （ neor） 、 ? 慶大霉素抗性基因 （ gentr） 、 ? 潮霉素磷酸轉移酶 （ HTP） 基因 （ hpt ） ? 膦絲菌素乙酰轉移酶基因 （ bar） 等 。 二、報告基因 ? 報告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定 、常用于判斷外源基因是夠成功地導入體細胞 ， 是否啟動表達的一類特殊用途的基因 。 ? 它應用不依賴于外界選擇壓力的存在 ， 這一點也是它與選擇基因的區(qū)別之處 。 理想報告基因的基本要求 ? 受體細胞不存在相應的內源等位基因的活性 。 ? 它的產(chǎn)物是唯一的 ， 且不會損害受體細胞 。 ? 具有快速 、 廉價 、 靈敏 、 定量和可重復性的檢測特性 。 目前最常用的報告基因 223。 葡萄糖苷酸酶基因（ gus） 氯霉素乙酰轉移酶基因 熒光素酶基因 四、轉化體的鑒定和證實 轉化體的鑒定和證實的必要性 ? 為了驗證外源基因整合到染色體 。 ? 常采用 PCR技術 、 Southern雜交技術 . ? 為了驗證外源基因是否表達 。 ? 常采用 RTPCR技術 、 Northern雜交技術 、Western雜交技術 。 PCR檢驗外源基因的整和 ? 在轉基因個體的檢測中 ,通過設計外源基因兩端的特異引物 ,采用 PCR基因可以使外源基因得到大量擴增 ,然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測特意擴增帶的有無 ,從而判斷外源基因是否整合到受體植物的基因組 。 ? 優(yōu)點 :由于對模板 DNA的要求少 ,適合與轉基因體的早期檢測 . ? 缺點 :容易受到外界因素的干擾 . Southern雜交檢測外源基因的整合 ? 原理 :來源不同但具有互補序列的兩條多核苷酸鏈通過 WastonCrick堿基配對原則形成穩(wěn)定的結構 .其中一條被標記成為探針 ,探針與互補的核苷酸序列雜交 ,通過放射自顯影技術可以被檢測出來 . ? 雜交方式 :Southern斑點雜交 Southern印記雜交 (最常用 ) Southern原位雜交 RT雜交檢測外源基因的整合 ? 適用范圍 :外源基因在受體細胞是否轉錄的初步檢測 . ? 原理 :以轉基因個體總 RNA或 mRNA為模板進行反轉錄 ,然后 PCR擴增 ,如果可以獲得特意的 cRNA擴增條帶 ,則表明外源基因實現(xiàn)了轉錄 . ? 優(yōu)點 :簡單 快速 對 mRNA抽提的數(shù)量和質量都要求不高 . Northern雜交檢測外源基因的表達 ? 與 Southern 的不同是 :固體膜上轉移固定的是 總 RNA或 RNA形成RNADNA雜交雙鏈 .通過放射自顯影的強度可以判斷外源基因的表達水平 . ? 分類 : 斑點雜交 (假陽性率高 .不常用 ) 印跡雜交 (比較常用 ) Western雜交檢測外源基因表達的產(chǎn)物 ? 適用范圍 :檢測外源基因在蛋白質水平上的表達 . ? 原理 :從轉基因材料中提取總蛋白或者目的蛋白 ,經(jīng)SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳把蛋白質按分子大小分離 ,在轉移到固體膜上 ,然后加入特異抗體 .膜上的目的蛋白與一抗結合 ,再加入帶標記的二抗 ,最后通過二抗上的標記物的性質進行檢測 . 植物基因工程研究的應用和展望 ? 一 抗性基因工程 （ 抗蟲 、 抗除草劑 、 抗病 、 抗逆 ） ? 二 植物品質改良基因工程 （ 蛋白質 、 碳水化合物和脂肪品質改良 、 果品的成熟品質改良觀賞園藝植物的品質改良 ） ? 三 植物雜種優(yōu)勢的利用 ? 四 植物代謝工程 （ 重點在于改良植物品質 ,增加營養(yǎng) ,提高食物的醫(yī)療保健功能 ,或用做工業(yè)原料 ,增加農(nóng)副產(chǎn)品的附加值 。 ） 謝謝 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH
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