生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)(參考版)
2024-12-31 15:03本頁面
【正文】 ? 優(yōu)點(diǎn) :由于對模板 DNA的要求少 ,適合與轉(zhuǎn)基因體的早期檢測 . ? 缺點(diǎn) :容易受到外界因素的干擾 . Southern雜交檢測外源基因的整合 ? 原理 :來源不同但具有互補(bǔ)序列的兩條多核苷酸鏈通過 WastonCrick堿基配對原則形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu) .其中一條被標(biāo)記成為探針 ,探針與互補(bǔ)的核苷酸序列雜交 ,通過放射自顯影技術(shù)可以被檢測出來 . ? 雜交方式 :Southern斑點(diǎn)雜交 Southern印記雜交 (最常用 ) Southern原位雜交 RT雜交檢測外源基因的整合 ? 適用范圍 :外源基因在受體細(xì)胞是否轉(zhuǎn)錄的初步檢測 . ? 原理 :以轉(zhuǎn)基因個體總 RNA或 mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 ,然后 PCR擴(kuò)增 ,如果可以獲得特意的 cRNA擴(kuò)增條帶 ,則表明外源基因?qū)崿F(xiàn)了轉(zhuǎn)錄 . ? 優(yōu)點(diǎn) :簡單 快速 對 mRNA抽提的數(shù)量和質(zhì)量都要求不高 . Northern雜交檢測外源基因的表達(dá) ? 與 Southern 的不同是 :固體膜上轉(zhuǎn)移固定的是 總 RNA或 RNA形成RNADNA雜交雙鏈 .通過放射自顯影的強(qiáng)度可以判斷外源基因的表達(dá)水平 . ? 分類 : 斑點(diǎn)雜交 (假陽性率高 .不常用 ) 印跡雜交 (比較常用 ) Western雜交檢測外源基因表達(dá)的產(chǎn)物 ? 適用范圍 :檢測外源基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá) . ? 原理 :從轉(zhuǎn)基因材料中提取總蛋白或者目的蛋白 ,經(jīng)SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳把蛋白質(zhì)按分子大小分離 ,在轉(zhuǎn)移到固體膜上 ,然后加入特異抗體 .膜上的目的蛋白與一抗結(jié)合 ,再加入帶標(biāo)記的二抗 ,最后通過二抗上的標(biāo)記物的性質(zhì)進(jìn)行檢測 . 植物基因工程研究的應(yīng)用和展望 ? 一 抗性基因工程 （ 抗蟲 、 抗除草劑 、 抗病 、 抗逆 ） ? 二 植物品質(zhì)改良基因工程 （ 蛋白質(zhì) 、 碳水化合物和脂肪品質(zhì)改良 、 果品的成熟品質(zhì)改良觀賞園藝植物的品質(zhì)改良 ） ? 三 植物雜種優(yōu)勢的利用 ? 四 植物代謝工程 （ 重點(diǎn)在于改良植物品質(zhì) ,增加營養(yǎng) ,提高食物的醫(yī)療保健功能 ,或用做工業(yè)原料 ,增加農(nóng)副產(chǎn)品的附加值 。 ? 常采用 RTPCR技術(shù) 、 Northern雜交技術(shù) 、Western雜交技術(shù) 。 葡萄糖苷酸酶基因（ gus） 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 熒光素酶基因 四、轉(zhuǎn)化體的鑒定和證實(shí) 轉(zhuǎn)化體的鑒定和證實(shí)的必要性 ? 為了驗(yàn)證外源基因整合到染色體 。 ? 具有快速 、 廉價(jià) 、 靈敏 、 定量和可重復(fù)性的檢測特性 。 理想報(bào)告基因的基本要求 ? 受體細(xì)胞不存在相應(yīng)的內(nèi)源等位基因的活性 。 二、報(bào)告基因 ? 報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定 、常用于判斷外源基因是夠成功地導(dǎo)入體細(xì)胞 ， 是否啟動表達(dá)的一類特殊用途的基因 。 一、植物基因工程中的選擇基因 ? 植物基因工程中的基因主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因 。 ? 一般情況下 ， 轉(zhuǎn)化載體上除了帶有目的基因外 ，大多還攜帶選擇基因 ， 以供轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選使用 。 （ 3） 基因槍法適于以細(xì)胞器為轉(zhuǎn)化目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因研究 。 (2） 基因槍法 :純物理轉(zhuǎn)化 ， 不存在物種的限制 。 基因槍法與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)發(fā)的比較 (1) 基因槍法 : 多拷貝整合概率高 ， 外源基因默表達(dá) 。 Ti質(zhì)粒 ? Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì) ，為 雙股共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA分子 ， 其分子量為 95～ 156 106D， 約有 200kb。 把瘤組織培養(yǎng)在不加生長素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上 ， 能夠無限止的分裂和生長 。 細(xì)菌 DNA中的編碼基因在植物細(xì)胞中表達(dá) ， 刺激植物細(xì)胞不受控制的分裂 ， 形成瘤 。 ? ： 由根癌農(nóng)桿菌對植物的侵染而引起 。 引起癭的因素有：受傷 、 昆蟲 、 病毒 、 細(xì)菌和特定的基因組織表達(dá)等 。 冠癭瘤 ? 植物與人一樣 ， 可以產(chǎn)生各種各樣的瘤和癌 。 ? 根據(jù)根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物形成的根瘤中冠癭堿的不同可將根癌農(nóng)桿菌分為章魚堿型 、 胭脂堿型 、 農(nóng)桿菌素堿和農(nóng)桿堿型 4種類型 。 ?優(yōu)點(diǎn)：操作簡便； ? 工作效率高； ? 無宿主限制 ， 適應(yīng)于各種動植物； ? 對受體細(xì)胞生命活動影響?。? ? 受體的類型廣泛； ? 用于細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)化 ． 二 基因槍法（微彈轟擊法） ? 工作原理：將外源 DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面 ， 然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體細(xì)胞或組織 ， 微粒上的外源 DNA進(jìn)入細(xì)胞后 ， 整合到植物染色體上并得到表達(dá) ， 從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化 。 優(yōu)點(diǎn)： 方法簡單 、 轉(zhuǎn)化率高；純物理方法 ， 適用于各種植物和材料 ， 無局限性；對受體細(xì)胞無毒害 ，有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長發(fā)育；培養(yǎng)過程無需特殊選擇系統(tǒng) 。 ? 特點(diǎn)： ? 轉(zhuǎn)化率高； ? 操作簡便 ； ? 容易造成原生質(zhì)體損傷 。 ? 技術(shù)性高 。 ? 特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高 。 ? 主要方法 : ? 1) PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 ? 2) 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 ? 3) 電激法 ? 4) 激光導(dǎo)入法 ? 5) 顯微注射法 1 PEG介導(dǎo)的基因
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