【正文】 序列下游約 1035nt。另一個(gè)切割信號(hào)位于切割位點(diǎn)下游約50nt，這個(gè)序列（ GUGUGUG ）通常富含 U或 GU。 Cap Cap 特異 內(nèi)切酶識(shí)別AAUAAA及隨后的GUGUGUG并在其間酶切，然后在 3‘ 端聚合 50200poly(A) GUGUGUG 2. 3’ 切割及 poly（ A） ? 切割因子 （ cleavage factor）切割 RNA產(chǎn)生 3’ 末端； ? 腺苷酸聚合酶 在 3’ 末端聚合 A； ? poly(A)結(jié)合蛋白 結(jié)合到 poly(A)上，形成復(fù)合物； ? 復(fù)合物在聚合了約 200nt的 A之后從 RNA上釋放。 注：并非所有 mRNA都有 polyA 3. 內(nèi)含子的剪接（ splicing） ? 一個(gè)基因的內(nèi)含子和外顯子共同轉(zhuǎn)錄在一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物當(dāng)中，然后將內(nèi)含子去除而把外顯子連接起來(lái)形成成熟的 RNA分子。這個(gè)過(guò)程就稱為RNA的剪接（ splicing）。 ? 它是通過(guò)一個(gè)套索 (lariat)進(jìn)行的。內(nèi)含子上游的剪接點(diǎn)稱為 5’ 剪接點(diǎn)或左剪接點(diǎn)，下游方向的剪接點(diǎn)稱為 3’ 剪接點(diǎn)或右剪接點(diǎn)。剪接通過(guò)轉(zhuǎn)酯作用進(jìn)行。盡管對(duì) RNA的剪接過(guò)程和機(jī)制已有了一定的了解，但仍有很多問(wèn)題還不十分明確，比如：如何保證剪切位點(diǎn)選擇的正確性。 GUAG（ GUAG）規(guī)則 ? 剪接連接點(diǎn) (splicing junctions)是內(nèi)含子與外顯子的斷裂點(diǎn)及相鄰內(nèi)含子的連接點(diǎn)。在內(nèi)含子左側(cè)的連接點(diǎn)稱為供體 (donor)，在內(nèi)含子右側(cè)的稱為受體 (acceptor)。 ? 在細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)基因中的所有內(nèi)含子在外顯子 內(nèi)含子連接處均有 GU． ..AG的共同順序。即這些內(nèi)含子的左端（ 5’端）均為 GU，右端（ 3’ 端）均為 AG，稱為 GUAG規(guī)則（ GUAG rule）。 ? 與自身剪接不需能量不同，核內(nèi)剪接需要 ATP供能。 GUAG（ GUAG）規(guī)則 ? 真核生物基因組中的大多數(shù)內(nèi)含子都遵循此規(guī)則，而線粒體、葉綠體基因的內(nèi)含子以及 tRNA和 rRNA核基因的內(nèi)含子不遵守此規(guī)則。 ? 外顯子 ...AGU↓GTAAGT... 內(nèi)含子 ...Py10CAG↓... 外顯子 （ 1） RNA內(nèi)含子的剪接機(jī)制 自我剪接 ( s e l f splicing ) I型：分布廣泛 ， 研究較詳細(xì)的為四膜蟲(chóng) rRNA II型：只見(jiàn)于某些真菌線粒體和植物葉綠體基因 剪接體 幫助下的剪接：由剪接體完成 ， 如：真核生物基因組的 mRNA內(nèi)含子 ， 剪接方式與 II型內(nèi)含子的剪接類似 酶促剪接：需蛋白質(zhì) （ 酶 ） 的參與 ， 主要在 tRNA前體中發(fā)現(xiàn) ，如酵母 tRNA前體 （ 1） RNA剪接機(jī)制 (2) I型內(nèi)含子自我剪接 ? I型自我剪接通過(guò) 3步的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)進(jìn)行， 需要一個(gè)外來(lái)的帶有自由 3’ OH的 G。 ? ①外來(lái)的 G提供游離的3’ OH攻擊內(nèi)含子 5’ 端，使內(nèi)含子 5’ 端上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移其上； ? ②產(chǎn)生的外顯子的游離3’ OH攻擊內(nèi)含子 外顯子分子上的 5’ 磷酸基，外顯子連接； ? ③內(nèi)含子自身的 3’ OH攻擊 5’ 端第 15個(gè) nt 處的磷酸基，形成一個(gè)環(huán)狀分子和一小段 15聚核苷酸（含 G）。 (2) I型內(nèi)含子自我剪接 ? 四膜蟲(chóng) 35S rRNA前體的剪接 可通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。一條泳動(dòng)迅速的小帶表明線狀的內(nèi)含子被切除了，而當(dāng)內(nèi)含子由線狀變?yōu)榄h(huán)狀時(shí)，其電泳速度減慢，所處位置較高。 核酶（ ribozyme） ? 1981年 Cech在研究一種 四膜蟲(chóng)（ Tetrahumena thermophila）的 rRNA前體剪接過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，此類剪接無(wú)需蛋白質(zhì)的酶的參與，而是自我催化完成的。Cech稱這種具有催化功能的 RNA為核酶（ ribozyme）。 ? 核酶目前發(fā)現(xiàn)有兩種類型：I型和 II型內(nèi)含子都是 剪接型核酶。而 RNaseP中的 RNA分子（ M1RNA）則是 剪切 型核酶，只剪不接。 Thomas R. Cech Cech給具有催化活性的 RNA定名為 ribozyme。他和 Altrman共同獲得了 1989年 Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。 1989年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) （ 3） II型內(nèi)含子自我剪接 ? II型內(nèi)含子本身具有催化功能，能夠自我剪接。它與 I型內(nèi)含子自我剪接的區(qū)別在于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)無(wú)需游離鳥(niǎo)苷酸或鳥(niǎo)苷的啟動(dòng)，而是由內(nèi)含子靠近 3’端的腺苷酸 2’ OH攻擊 5’ 磷酸基引起。 自我剪接通過(guò)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)進(jìn)行。 Group II由內(nèi)含子靠近 3’ 端的 A提供自由的羥基；group I 的自由羥基則來(lái)自外來(lái)的 G。 5’ 3’ 5’ 經(jīng)過(guò)兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)后， 內(nèi)含子形成套索結(jié)構(gòu)（ lariat）被切除 ， 兩個(gè)外顯子連接。 （ 4）剪接體幫助下的剪接 （核基因 mRNA剪接機(jī)制）： ? 核內(nèi)不均一 RNA（ heterogeneous nuclear RNA, hnRNA）的分子質(zhì)量變化很大，故稱為不均一 RNA。 ? hnRNA是真核生物基因初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即 mRNA的前體，每個(gè)核基因約有 8個(gè)內(nèi)含子，剪接時(shí)在各個(gè)內(nèi)含子上分別形成各自的剪接體 ? 各種參與剪接的成分形成一個(gè)剪接體系，稱為 剪接體（ splicesome）， 約 5060S，與核糖體的大亞基相似。 剪接體 （ splicesome） ? 真核生物 mRNA前體在剪接過(guò)程中組裝形成的多組分復(fù)合物 ，主要由細(xì)胞核內(nèi)小分子 RNA（ snRNA）和蛋白質(zhì)因子組成，即剪接體是一種具有催化剪接反應(yīng)的 核糖核蛋白復(fù)合體 。 ? 剪接體 =幾種 snRNP（細(xì)胞核中的小分子 RNA以核蛋白顆粒的形式存在，稱為snRNP） +大量的其它的 蛋白質(zhì) 分子。 參與剪接的 snRNP至少 5種， U U U4/U6和 U5snRNP。 snRNP ? 真核生物 mRNA前體內(nèi)含子的兩個(gè)末端和分支點(diǎn)的共同序列都是由相應(yīng)的 RNA或蛋白質(zhì)識(shí)別的，snRNA是識(shí)別這些序列信號(hào)的關(guān)鍵性因子。 ? snRNA和蛋白質(zhì)偶聯(lián)就形成 snRNP，用電泳的方法能夠分離出 U U U U U6等各個(gè)組分。 ? 在 snRNP中，有些蛋白質(zhì)參與剪接，有些則只起結(jié)構(gòu)蛋白的作用。 ? 參與剪接的蛋白質(zhì)除極少數(shù)之外，大多數(shù)都是snRNP的組分，統(tǒng)稱為剪接因子（ splicing factor）。 U1 snRNP initiates splicing snRNAs中最受注意的一個(gè)是 U1，它普遍存在于哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類和昆蟲(chóng)細(xì)胞中。其 5‘ 端的 11個(gè)核苷酸是單鏈的，并有一段和內(nèi)含子左側(cè)的供體序列互補(bǔ)。在供體位點(diǎn)處的互補(bǔ)序列通常為 46bp。 人 U1snRNP中除 RNA外還 8個(gè)蛋白質(zhì)分子。 剪接過(guò)程 剪接過(guò)程 ① 內(nèi)含子 5’ 端 （供體位點(diǎn)） 被切開(kāi)，形成游離的線性的左側(cè)外顯子和右側(cè)的內(nèi)含子 外顯子分子。內(nèi)含子游離的 5’ 端剪接點(diǎn)以 5’ 2’ 磷酸二酯鍵與 分支位點(diǎn) （內(nèi)含子 3’ 端上游約 30nt處的一個(gè)高度保守的 CTGAC序列 (共同序列 )中的 A）相連，形成一個(gè) 套索 (lariat)； ② 內(nèi)含子 3’ 端剪接點(diǎn)（受體位點(diǎn)） 被切斷而以套索狀釋放，同時(shí)右側(cè)外顯子與左側(cè)外顯子連接； ③ 內(nèi)含子的套索被切開(kāi)，形成線狀并很快被降解。 ? 三個(gè)結(jié)構(gòu)保守的剪接信號(hào) ： 5’ GU、 3’ AG和分支點(diǎn)序列（ CTGAC序列 (共同序列 )中的 A ）。 剪接過(guò)程 ? 剪接反應(yīng)通過(guò)幾個(gè)不連續(xù)的步驟進(jìn)行。剪接體的形成包括能識(shí)別共同序列的分子間的相互作用。 （ 5）酶母 tRNA的酶促剪接 tRNA的剪接需要內(nèi)切酶及 RNA連接酶活性。 外顯子 內(nèi)含子邊界在 內(nèi)切酶 作用下被切斷，產(chǎn)生2’ ， 3’ 環(huán)磷酸基和5’ OH末端。環(huán)磷酸基可開(kāi)環(huán)產(chǎn)生 3’ OH和 2’ 磷酸基。 5’ OH可以磷酸化。 內(nèi)含子被釋放后，兩個(gè) tRNA半分子折疊成一個(gè)類似 tRNA的結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)具有 3’ OH和一個(gè) 5’ P。兩者的連接反應(yīng)由 RNA連接酶 完成。 （ 6）內(nèi)含子的選擇性剪接 （ alternative splicing） ? 選擇性剪接 一個(gè)基因的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過(guò)不同的剪接方式，可以得到不同的成熟 mRNA，稱為選擇性剪接 。 ? α 原肌球蛋白基因，通過(guò)選擇性剪接可得到 10個(gè)不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。 ? 真核生物中，大約 5%的 mRNA前體有一種以上的剪接方式。 本章要點(diǎn) ? 有義鏈、反義鏈、啟動(dòng)子（ 35區(qū)， 10區(qū)，起點(diǎn)，TATA box， Pribnow box ）、終止子、 σ 因子、核心酶、全酶、 ρ 因子、帽子位點(diǎn)（ cap site）、 snRNA、scRNA、 hnRNA、 snRNP、原核生物 RNA聚合酶的組成、TBP、真核生物 RNA pol II的 CTD、轉(zhuǎn)錄因子、 TFIIH、核糖核蛋白復(fù)合體（ RNP）、核酶、 tRNA的 CCA序列、內(nèi)含子、外顯子、選擇性剪接、剪接體、 GUAG規(guī)則 ? σ 因子和 ρ 因子的作用 ? 原核生物 RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程 ? 真核生物基因的結(jié)構(gòu) ? 原核生物 RNA聚合酶和啟動(dòng)子結(jié)構(gòu) ? 真核生物細(xì)胞核內(nèi)的三種 RNA聚合酶和三種啟動(dòng)子 ? mRNA轉(zhuǎn)錄后加工的內(nèi)容 ? 內(nèi)含子剪接的四種類型 ? 核酶的類型