【正文】 原為還原型細胞色素 C，后者在 550nm有最大吸收，因此測定氧化性細胞色素 C在加入 SOD前后的光吸收變化可間接計算酶活性。 79 方法 ? 80 注意點 ? 在特定條件下， 25 ℃ （ ）每分鐘抑制細胞色素 C還原速率達 50％所需要的酶量為一個活力單位。 ? 注意事項： ? 重金屬離子易使黃嘌呤氧化酶失活，因此反應(yīng)體系中必須添加 EDTA。 ? 反應(yīng)體系中含過氧化氫酶可引起還原型細胞色素C發(fā)生過氧化作用，從而干擾檢測的正確。 81 鄰苯三酚法 ? 原理： 在堿性條件下，鄰苯三酚會發(fā)生自氧化生成紅 酚，同時生成 O2 ，當有 SOD 存在時由于它能催化 O2 與 H+結(jié)合生成 O2和 H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累。 ? 定義 :在一定條件下， 每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達 50％的酶量 為一個酶活力單位。 82 操作 ? 定義 :在一定條件下， 每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達 50％的酶量 為一個酶活力單位。 83 門冬酰胺酶（ LAsparaginase） ? 本品系自大腸桿菌（ Ecoli ）中提取制備的具有 酰氨基水解作用的酶。 ? 每毫克蛋白含門冬酰胺酶效價不得低于 250U。 抗腫瘤酶類藥物 (腫瘤細胞缺乏 L門冬酰胺合成酶 )。 ? 治療小兒急性淋巴細胞性白血病和淋巴肉瘤。 84 測定 ? 在上述規(guī)定條件下，每分鐘催化 L門冬酰胺水解 釋放1μg分子氨所需的酶量 定義為 1個酶活力單位 ? 比活力測定方法：采用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量，比活力 =酶活力 (U)/蛋白含量 (mg)。 85 天冬氨酸酶活力的測定 ， 一個酶活力單位定義為在測定條件下， 每小時每克 細胞轉(zhuǎn)化生成 1181。mol天冬氨酸所需的酶量 . 86 實例：尿激酶（ urokinase） ? 本品系從 新鮮人尿中提取 的一種 激活纖維蛋白溶酶原 的酶 。 ? 由高分子量 54000和低分子量 33000組成的混合物 ， 高分子量含量不得少于 90%， 每1mg蛋白中尿激酶活力不得少于 12萬 U， 蛋白分解藥物 。 87 尿激酶 ? （ 一 ） 性狀 ? 本品為白色非結(jié)晶狀粉末 ? （ 二 ） 鑒別 ? 取比活力測定項下的 供試品 溶液 ， 用巴比妥 氯化鈉緩沖液 （ ） 稀釋成每 1ml中含 20U的溶液 ，吸取 1ml， 加 纖維蛋白原 溶液 ， 再依次加入纖維蛋白溶酶原 溶液 ， 凝血酶 溶液 ， 迅速搖勻 ， 立即置 37177。 ℃ 恒溫水浴中保溫 ， 記時 ，反應(yīng)系統(tǒng) 應(yīng)在 30～ 45s內(nèi)凝結(jié) ， 且凝塊在 15min內(nèi)重新溶解 。 以 %氯化鈉溶液作空白 ， 同法操作 ，凝塊在 2h內(nèi)不溶 。 88 （三）檢查 ? 1． 溶液的澄清度與顏色 ， 應(yīng)澄清無色 。 ? 2． 分子組分比 取本品 ， 加水制成每 1ml中含 2mg的溶液后 ， 加入等體積的緩沖液 ， 置水浴中 3min，放冷 ， 作為供試品溶液；取供試品溶液 10μl， 加至樣品孔 ， 照電泳法測定 ， 按下式計算高分子尿激酶相對含量 （ %） 。 89 （三）檢查 ? 3． 干燥失重 取本品 ， 以五氧化二磷為干燥劑 ， 在60℃ 減壓干燥至恒重 ， 減失重量不得過 %。 ? 4． 異常毒性取本品 ， 加氯化鈉注射液制成每 1ml中含 5000U的溶液 ， 依法檢查 ， 按靜脈注射法給藥 ，應(yīng)符合規(guī)定 。 ? 5． 熱原 取本品 ， 加氯化鈉注射液制成每 1ml中含20220U的溶液 ， 依法檢測 ， 按家兔體重每 1kg注射 1ml， 應(yīng)符合規(guī)定 。 90 6. 凝血質(zhì)樣活性物質(zhì) ? （ 1） 血漿的制備 。 ? （ 2） 復鈣試驗 取小試管 ， 加 血漿 、 6氨基己酸溶液 妥緩沖液 ， 再加入 氯化鈣 溶液觀察凝固時間 。 以凝固時間最短的一管所加的氯化鈣量 ， 為復鈣試驗的氯化鈣溶液用量 。 ? （ 3） 測定法 取小試管加入上述倍比稀釋的供試品溶液各 ， 再依次加入上述 6氨基己酸溶液和血漿各 ， 輕輕搖勻 ， 在 25℃ 水浴中 ， 靜置 2～ 3min， 迅速加入已預溫至 25℃ 的復鈣試驗所需的上述氯化鈣溶液用量 ， 混勻 ， 記錄放入時間 。 注意觀察血漿凝固 ， 觀察時輕輕傾斜 ， 避免影響凝血過程 ， 記錄凝固時間 。 ? 空白對照管凝固時間減去供試品管凝固時間等于 復鈣試驗?zāi)炭s短時間 。 ? 在單對數(shù)紙上 ， 以供試品溶液的 濃度為縱坐標 ， 以復鈣試驗?zāi)炭s短時間（ s） 為橫坐標 ， 繪圖 ， 連接不同稀釋度的供試品各點 ， 應(yīng)成一直線 ， 此直線外延至縱軸 ， 與縱軸的交點即表示供試品濃度 ， 也是凝血質(zhì)樣活性為零值時的供試品酶活力 ， 按每 1ml中供試品的單位表示 ， 每 1ml應(yīng)大于150U。 91 （四） 效價測定 (氣泡上升法 ) ? 原理：激活 纖維蛋白溶酶原 使其轉(zhuǎn)化成 纖維蛋白溶酶，纖維蛋白溶酶 具有較強的蛋白水解酶的能力。 ? 纖維蛋白原 在 凝血酶 的作用下，轉(zhuǎn)變成纖維蛋白凝塊，此凝塊在纖維蛋白溶酶作用下，水解為可溶性小分子多肽。在纖維蛋白溶酶原過量的情況下， 尿激酶量與纖維蛋白凝塊的溶解時間的對數(shù)成直線關(guān)系 。 92 操作 ? 93 計算： ? 以尿激酶的濃度為橫坐標，以反應(yīng)時間的對數(shù)為縱坐標 。 ? 注意： ? 影響效價測定的主要因素是 纖維蛋白溶酶原、凝血酶及纖維蛋白原 ，如發(fā)現(xiàn)標準曲線斜率低于 ，直線平坦，則纖維蛋白溶解酶原、凝血酶可能失活，需重新標定或更換。 ? 效價測定過程中，各試劑需置 37℃ 水浴中。 94 第三節(jié) 酶活力測定方法 ? 固定時間法 ? 連續(xù)監(jiān)測法 ? （一）、需 NAD+或 NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法： ? 直接測定法 ? 偶聯(lián)法 ? 三聯(lián)酶活測定 ? （二）、不需 NAD+或 NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法： ? 固定濃度法 95 第四節(jié) 酶活性測定方法的設(shè)計 ? 一、影響因素 ? 二、底物與產(chǎn)物的測定方法 ? 三、 測定條件的選擇 ? 單因素選擇 ? 正交設(shè)計 —— 多因素選擇 96 第五節(jié) 酶類藥物的檢測 ? 肽鍵水解酶 ? 胰蛋白酶 ? 彈性蛋白酶 ? 尿激酶 （ 氣泡上升法 ） ? 脂鍵水解酶 —— 胰脂肪酶 ? 糖苷鍵水解酶 —— 溶菌酶 ? 其它 （ 超氧化物歧化酶，門冬酰胺酶 ）