細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)-資料下載頁(yè)
2025-08-15 20:39本頁(yè)面
【正文】 。 ? 常用的低溫保護(hù)劑是 DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。 細(xì)胞凍存方法 1. 凍存液配制：含 20%血清培養(yǎng)基 ,10% DMSO 2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?, 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（ 1 106 ～ 5 106細(xì)胞 /ml) 3. 加入 1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名 稱和冷凍日期。 4. 年后，存活率可達(dá) 80％以上。 DMSO液用培養(yǎng)液配好， 5. 避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。對(duì)人造血干細(xì)胞的研究證 細(xì)胞復(fù)蘇方法 1. 從液氮中取出冷凍管，迅速投入 37~38 ℃水浴中，使其融化（ 1分鐘左右）。 2. 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的 10倍以上。 3. 低速離心 10分鐘。 4. 去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。 培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定 任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。 1. 細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn) 2. 臺(tái)盼藍(lán)法 3. 四唑鹽（ MTT）比色法 1. 細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)： 單個(gè)細(xì)胞在體外增殖 6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見(jiàn)的克隆?？寺⌒纬勺溆脕?lái)表示細(xì)胞的增殖能力。 克隆形成率比＝克隆形成數(shù)／接種細(xì)胞數(shù) 缺點(diǎn)：操作繁瑣 優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠 活細(xì)胞不被染色 ， 死細(xì)胞染成藍(lán)色 ， 用活細(xì)胞占 細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力 。 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞 3. 四唑鹽（ MTT）比色法 MTT名為噻唑藍(lán) ，其原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四 唑 鹽還原成不溶干水的，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜 （ DMSO） 能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的藍(lán)紫色產(chǎn)物量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定 OD值 MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。 操作步驟 : 1. 單細(xì)胞懸液接種于 96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)基總量200微升、 37℃ 、 5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）。 2. 加入 5毫克／毫升的 MTT液（ 20微升／孔），繼續(xù)培養(yǎng) 4小時(shí)。 3. 吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入 DMSO液（ 150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩 10分鐘，使結(jié)晶物溶解。 4. 酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔 OD值（檢測(cè)波長(zhǎng) 570nm）。記錄結(jié)果，繪制曲線。
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