基因重組-生物合成概念-資料下載頁
2025-08-04 15:14本頁面
【正文】 由于pBR322質(zhì)粒的親本之一是pMB1質(zhì)粒，故首先以pMB1為基礎(chǔ)，引入Rldrd19質(zhì)粒的Tn3易位子，； pMB3的分子量顯然使得它不適合作為載體，所以要通過在EcoRI活性條件下的消化讓它大部分的無用片段失去，留下來的小片段的DNA的黏性末端連接起來后就形成了pMB8質(zhì)粒（）； 此時(shí)，另外一種pSC101質(zhì)粒在EcoRI活性條件下消化產(chǎn)生了含有tetr抗性的DNA片斷，這個(gè)片斷和pMB8整合在一起就形成了pMB9質(zhì)粒（）。此時(shí)pMB9為ampstetr表型； pMB9已經(jīng)初步具備載體的功能，為了讓它更加完善，我們要讓它具備amprtetr性能，即在pMB9上引入pSF2124的Tn3易位子，但Tn3可以來也可以走，為了留住它，我們切去了Tn3中表達(dá)轉(zhuǎn)位酶的基因，形成了pBR313質(zhì)粒?！ 〈撕笪覀儽謨陕罚阂宦钒裵BR313的PstI位點(diǎn)除去，使之成為ampstetr表型的pBR318質(zhì)粒； 5；另一路把pBR313的EcoRII的位點(diǎn)切除，使之成為amprtets表形的pBR320質(zhì)粒?！ ∮纱宋覀兊牡搅藘煞N功能互補(bǔ)的質(zhì)粒，這樣我們只要將他們雜交就可以得到一種接近全能的載體質(zhì)粒了，這就是pBR322 ?！ BR322的應(yīng)用 了解了pBR322的結(jié)構(gòu)和它的構(gòu)建過程之后，我們來看pBR322在基因工程中的應(yīng)用?！ BR322質(zhì)粒作為一種常用的基因克隆載體，在實(shí)際應(yīng)用中有著非常重要的地位，其中一個(gè)突出的例子就是應(yīng)用pBR322 作為克隆載體對水稻的葉綠體光誘導(dǎo)基因psbA 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析?！ ⑺救~綠體的DNA，用EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶消化之后，放入含有溴化乙錠的低熔點(diǎn)（LMP）的1%瓊脂糖凝膠中作電泳分離?！倥c同樣經(jīng)過了EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理的pBR322質(zhì)粒連接。然后，將混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌5346菌株，培養(yǎng)在氨芐青霉素選擇平板上，形成Ampr轉(zhuǎn)化子菌落群體。這樣就構(gòu)成了由EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶切割的水稻葉綠體DNA基因組庫。用Ampr轉(zhuǎn)化子菌落與32P放射性標(biāo)記的玉米psbA DNA 探針作菌落雜交，可以分離出其中的陽性克隆體。從這些陽性克隆體中分離出來的重組體質(zhì)粒DNA，經(jīng)過進(jìn)一步的分析，就能測出水稻葉綠體基因psbA的序列。 利用pBR322作為載體重組人體的抑生長激素也是一個(gè)經(jīng)常提到的應(yīng)用例子。其過程和水稻葉綠體基因重組大同小異，只是除了在質(zhì)粒載體上插入抑生長激素基因外，還將含有l(wèi)ac操縱子起始部分的片段（包括啟動子、操縱區(qū)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和β－半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生長激素基因的旁邊。由于有了lac操縱子的控制，重組基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)就變得比較容易了。
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