【正文】 組織區(qū)植物細胞合成代謝旺盛，細胞分裂活躍，細胞的正常核蛋白的合成占優(yōu)勢，病毒競爭不到營養(yǎng)無法自身繁殖，而在細胞伸長期間病毒蛋白合成就可以占優(yōu)勢，造成病毒蔓延。指示植物鑒定(test plants) 所謂指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的專化性癥狀的寄主植物。將再生植物葉片汁液接種到指示植物上根據(jù)發(fā)病情況確定脫毒效果。 血清鑒定(serologic test) 試管沉淀反應；免疫雙擴散；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA：利用抗體抗原反應，將病毒制成抗體，再生植株葉片為抗原。）。⒈及時發(fā)現(xiàn)撥除變異植株。⒉對于表現(xiàn)優(yōu)良的變異植株，要和育種相結合培育新品種。人工種子亦稱體細胞種子。早期的人工種子概念是：體細胞胚經過人工種皮包被后而形成的體細胞種子。 現(xiàn)在指任何一種經人工種皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖體均可稱之為人工種子?？蓪⑷斯しN子分為三大類： 裸露的或休眠的繁殖體 如微鱗莖，微塊莖等。它們在不加包被的情況下也具有較高的成株率。 人工種皮包被的繁殖體 一些體細胞胚、原球莖等不能過度干燥，但只需要用人工種皮包被即可維持良好的發(fā)芽狀態(tài)，如胡蘿卜體細胞胚。 水凝膠包埋再包被人工種皮的繁殖體 大多數(shù)體細胞胚、不定芽、莖尖等均需要先包埋在半液態(tài)凝膠中，再經人工種皮包裹才能避免失水，從而維持良好的發(fā)芽能力。： 一類是體細胞胚人工種子； 另一類是非體細胞胚人工種子 在無性繁殖植物中，有可能建立一種高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品種的種性，又可以使之具有實生苗的復壯效應； 可以對優(yōu)異雜種種子不通過有性制種而快速獲得大量種子，特別是對于那些制種困難的植物更具有主要的適用意義； 對于一些不能正常產生種子的特殊植物材料如三倍體、非整倍體、工程植物等，有可能通過人工種子在短期內加大繁殖應用； 與田間制種相比，可以節(jié)省制種用地，且不受季節(jié)限制，可以實現(xiàn)工廠化生產，同時還避免了種子攜帶病原菌的危險； 與利用試管苗相比，可以避免移栽困難，且可以實現(xiàn)機械化操作，同時還便于儲藏和運輸。 這一技術不僅證實了細胞具有再生植株的“全能性”，而且對研究細胞生長、分化過程中的遺傳、生理、生化和代謝無疑有著重要意義。16. 體細胞胚規(guī)?；a的要求作為人工種子繁殖體的體細胞胚，其基本要求是要具有發(fā)育上的同步性，還必需滿足如下標準特征： 其一，形態(tài)正常，具有完整的胚結構；其二，與母體植物的基因型基本相同，特別是在重要經濟性狀和農藝性狀上沒有變異； 其三，具有較好的成熟性，能耐一定程度的脫水。 其次，作為實用化的體細胞胚種子還必需滿足一定的數(shù)量需求，規(guī)?；a是其基本前提。 前處理繁殖體的處理體細胞胚形成后，需要在無激素培養(yǎng)基上經過一定階段的后熟培養(yǎng)，然后進行脫水干燥，再將畸形胚選出后才能進行包埋。在脫水之前用ABA處理體細胞胚強迫其進入休眠，更有利于長期貯存。 微型變態(tài)器官繁殖體不能過度脫水，但亦需要適當干燥，除去表面及多余的水分，同時要進行表面消毒處理以繁殖包被后的感染。為了延長貯存時間，亦需根據(jù)使用季節(jié)進行適當?shù)男菝咛幚?。芽為繁殖體的類型，則不能進行脫水處理，但必需篩選生長健壯、組織充實的芽進行包埋。 18. 繁殖體的包埋介質的要求： 首先必需是對繁殖體及其它生物是無毒的，并具有一定的緩沖強度，以保證繁殖體在生產、運輸和種植操作中的安全。 同時，它最好能夠提供類似于胚乳的營養(yǎng)物質，以供繁殖體發(fā)芽的需要。 此外由于繁殖體的含水量較高，貯存中極易受到微生物感染危害，因此介質中還應含有適當?shù)臍⒕鷦?常用的兩種人工胚乳液配方MS（或SH、White）%的馬鈴薯淀粉水解物；SH（）%的麥芽糖。 19. 人工種子包埋程序以海藻酸鈉作包埋劑的操作程序是 在配制好的海藻酸鈉溶液中，按一定比例加入繁殖體并混勻。%%的CaCl2溶液中，經20－。 20. 人工種皮裝配理想的人工種皮應該是：具有一定的封閉性以保證人工胚乳的各種成分不易流失，同時又具有良好的透氣性，具有一定的堅硬度，以加強人工種子的耐儲運性和適于機械化操作。 無毒無害，能保證繁殖體順利穿透發(fā)芽， 配制簡單易行，成本低。 常用的人工種皮材料 早期使用Elvax 4260涂膜，價格昂貴，操作復雜、包裹效果不盡人意。 新近試驗使用的二氧化硅化合物材料包括疏水的Tullanox和微親水的CabOSil，二者均可以粉末狀包裹在人工種子膠囊外層，操作時只需將膠囊在上述材料中滾動即可完成包被過程，操作簡單易行，大量生產還可以機械化操作。 最近還報道一種硅酮種衣，它不僅可以抗真菌，而且可滲入水蒸氣和氧氣，這些材料均還處于試驗之中。 第六章 植物細胞培養(yǎng)與次生產物生產 細胞培養(yǎng)類型根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模:小規(guī)模培養(yǎng)和大批量培養(yǎng)； 根據(jù)培養(yǎng)方式:懸浮培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護培養(yǎng)； 根據(jù)要求產物:用于誘變的細胞培養(yǎng)和生產次生產物的細胞培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)概念、特點、目的、制備 懸浮培養(yǎng)是將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術。 液體狀態(tài)下便于細胞和營養(yǎng)物質的充分接觸和交換，細胞狀態(tài)可以相對保持一致，因此有利于在細胞水平上進行各種遺傳操作，生理生化活動的研究，同時為植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)提供了技術基礎。 基本特點是從愈傷組織的液體培養(yǎng)的基礎上發(fā)展起來的一種培養(yǎng)技術，主要有兩個基本特點：1．細胞可以不斷增殖，形成高密度的細胞群體，適于大規(guī)模生產2．可以提供大量的比較均勻的細胞，為深入研究細胞的生長、分化創(chuàng)造了一種很好的實驗方法和條件；愈傷組織只能提供細胞間可能已明顯分化的細胞。但是，這種理想狀態(tài)不容易得到。到目前為止，還不能完全做到只有游離的單細胞，通常里面還有小細胞團，這是由于植物細胞具有聚集在一起的特性。目的　 主要用于生產次生代謝產物，所以保持細胞停留在增殖階段是十分重要的，細胞勿需繼續(xù)分化懸浮系的制備 將疏松的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，經過搖床不斷振動，使細胞分散。 一般來說，分散比較好的細胞懸浮物是由薄壁細胞組成的。但有時還存在一些木質化的類管胞等成分，這些類管胞成分是引起細胞聚合的重要因素。通常適于愈傷組織生長的液體培養(yǎng)基也適用于同種植物細胞的懸浮培養(yǎng)。有時需要調節(jié)激素的濃度。懸浮培養(yǎng)對材料的要求 愈傷組織的要求：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，疏松易碎。 選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度；必要的附加物質。懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個優(yōu)點： 一是增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應； 二是在振蕩條件下可避免細胞代謝產生的有害物質在局部積累而對細胞自身產生毒害； 三是振蕩培養(yǎng)可以適當改善氣體的交換一個成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件：懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小，一般在30～50個細胞以下，在實際培養(yǎng)中很少有完全由單細胞組成的植物細胞懸浮系。 均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2～3天甚至更短時間便可增加一倍。 影響懸浮細胞生長的因素：起始愈傷組織的質量；接種細胞密度：接種初期的細胞密度過低往往使延遲期加長，～105個細胞/毫升，低于這一密度則會使細胞生長延遲；培養(yǎng)條件：方式、溫度、繼代周期細胞同步化指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。 植物細胞在懸浮培養(yǎng)中的游離性較差，容易團聚并進入不同程度的分化狀態(tài)，因此，要達到完全同步化對于植物細胞培養(yǎng)來講是十分困難的。 也正是因為同一培養(yǎng)體系的植物細胞通常并不能處于同一細胞周期，這種差異使懸浮細胞的分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等更趨復雜化。通過一定的理化措施可以使同一體系中的細胞達到相對同步化。饑餓法饑餓也是調整細胞同步化的方法之一。在一個培養(yǎng)體系中，如果細胞生長的基本成分喪失，則導致細胞因饑餓而分裂受阻，從而停留在某一分裂時期，當在培養(yǎng)基中加入所缺乏的成分或者將饑餓細胞轉入完整培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)時，則細胞分裂又可重新恢復。 饑餓導致的細胞分裂受阻常常是使細胞不能合成DNA，即不能進入S期，或細胞分裂不能進行，即不能進入M期。因此，通過饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化細胞。 抑制劑法通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，當解除抑制后，即可獲得處于同一細胞周期－G1期的同步化細胞。常用抑制主要有5－氟脫氧尿苷（5flouorodeoxyuridine，F(xiàn)udR）和羥基尿（hydoxyurea，HU）。 通過抑制劑獲得的同步化細胞基本處于同一個細胞周期，在除去抑制劑后可以不進行分選直接培養(yǎng)，分選法通過細胞體積大小分級是直接將處于相同周期的細胞進行分選，然后將同一狀態(tài)的細胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中，從而可能保持相同培養(yǎng)體系中的細胞具有較好的一致性。 這種方法的優(yōu)點是操作簡單，不影響細胞活力。精細度較差。常規(guī)細胞分選定方法是采用梯度離心的方法。 低溫處理冷處理也可以提高培養(yǎng)體系中細胞同步化的程度。Okamura等曾采用此途徑使胡蘿卜懸浮細胞較好的同步化。單細胞培養(yǎng)方法：（一）分離單細胞的方法1．物理方法：　　將疏松的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，經搖床不斷振動，使細胞分散。若向細胞懸浮液中吹入脈沖壓縮氣體，細胞分散的更好。2．化學方法：胡蘿卜細胞懸浮培養(yǎng)中加入草酸鈣（100μg/L）得到較分散的細胞。因為草酸鹽能結合細胞間質中果膠鈣的鈣離子。秋水仙素（）或2,4D或水解乳蛋白對細胞分散有一定的作用3．酶法：　　果膠酶和纖維素酶有利于細胞分離，但使用濃度不當容易引起細胞降解。（二）單細胞的培養(yǎng)方法1．液體淺層培養(yǎng)：　　先將細胞制成一定密度的細胞懸浮液，用吸管將懸浮液移到培養(yǎng)皿中形成淺層，一般1mm左右，石蠟膜封口，靜置培養(yǎng)?！　?yōu)點：培養(yǎng)物與空氣接觸面大，通氣性好；細胞代謝產物容易擴散，不會造成有害物質的危害,繼代培養(yǎng)方便、便于觀察?！　∪秉c：由于細胞可以游動，不能進行定點觀察2．微室培養(yǎng)（微滴培養(yǎng)）：40100μl　　優(yōu)點：可以連續(xù)觀察細胞的分化和發(fā)育；缺點：通氣性差。3．平板培養(yǎng)：　　優(yōu)點：便于定點觀察；缺點：通氣性較差4．看護培養(yǎng)；適用于難于培養(yǎng)的植物種類（三）培養(yǎng)細胞的密度及生活率的測定1．起始密度的測定：起始密度一般為104108個/ml 用記數(shù)板統(tǒng)計細胞數(shù)目2．植板率的測定：　 用平板培養(yǎng)的需要統(tǒng)計植板率，即每個平板接種細胞總數(shù)中形成細胞團的百分數(shù)。（四）植株再生 獲得了細胞團以后繼續(xù)培養(yǎng)形成愈傷組織 將大塊的細胞團或愈傷組織轉到分化培養(yǎng)基上再生植株。1單細胞培養(yǎng)方法細胞平板培養(yǎng) 所謂平板培養(yǎng)（plating culture）是指將一定密度的懸浮細胞接種到一薄層固體體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術。 平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長出細胞團的單細胞在接種單細胞中所占的比例。 看護培養(yǎng) 看護培養(yǎng)（nurse culture）技術首先是有Muir等（1954）設計的，其操作方法是在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長的愈傷組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙濕潤后將細胞接種于濾紙上。當培養(yǎng)細胞長出微小細胞團以后，將其直接轉至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長。 微室培養(yǎng) 微室培養(yǎng)（microchamber culture）是為進行單細胞活體連續(xù)觀察而建立的單細胞培養(yǎng)技術，運用這種技術可對單細胞的生長與分化、細胞分裂的全過程、胞質環(huán)流的規(guī)律等進行活體連續(xù)觀察。這一方法同樣也可用于原生質體培養(yǎng)，用于觀察細胞壁的再生與細胞分裂過程。微室培養(yǎng)是細胞學研究的優(yōu)良實驗體系。.雙層濾紙植板培養(yǎng) Horsch等（1980）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術相結合，建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法，該方法是在培養(yǎng)皿中倒入瓊脂培養(yǎng)基凝固后，先將飼養(yǎng)細胞平鋪在培養(yǎng)基上，然后在飼養(yǎng)細胞層上平展一張濾紙形成看護層，再將濾紙制成的圓碟置于看護層上，然后將培養(yǎng)細胞植于其中1植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)的技術要求 從工程的角度講必須要進一步研究和開發(fā)適宜于植物細胞生長和生產的生物反應器，建立最佳的控制和調節(jié)系統(tǒng)； 從培養(yǎng)技術方面講必須滿足以下三個條件：培養(yǎng)的細胞在遺傳上應是穩(wěn)定的，以得到產量恒定的產物；細胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內能得到較高產量的終產物；代謝產物要在細胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。種子細胞選擇種子細胞增殖與放大培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)體系建立2種子細胞選擇（外植體選擇、高產細胞選擇）植物類型：植物細胞的遺傳基礎是天然產物生產的基本影響因素，不同植物產生的天然產物種類之所以不同，從根本上來說是因為它們具有不同的遺傳基礎。在確定生產某一種化合物以后，首先必須準確選擇那些能夠產生目的化合物的植物種類及其品種或單株。 組織器官：由于天然產物一般為次生代謝產物，而植物次生代謝產物的積累具有組織器官特異性，因此，在起始細胞培養(yǎng)時應盡量選擇自然狀態(tài)下產生天然產物的器官、組織為外植體。 在大多數(shù)情況下，來自起始材料的細胞系通常是一個異質細胞群體，細胞間在次生產物積累能力上有很大差異。 為了提高篩選效率，還