【正文】 組織區(qū)植物細(xì)胞合成代謝旺盛，細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞的正常核蛋白的合成占優(yōu)勢，病毒競爭不到營養(yǎng)無法自身繁殖，而在細(xì)胞伸長期間病毒蛋白合成就可以占優(yōu)勢，造成病毒蔓延。指示植物鑒定(test plants) 所謂指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的?；园Y狀的寄主植物。將再生植物葉片汁液接種到指示植物上根據(jù)發(fā)病情況確定脫毒效果。 血清鑒定(serologic test) 試管沉淀反應(yīng)；免疫雙擴(kuò)散；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA：利用抗體抗原反應(yīng)，將病毒制成抗體，再生植株葉片為抗原。）。⒈及時發(fā)現(xiàn)撥除變異植株。⒉對于表現(xiàn)優(yōu)良的變異植株，要和育種相結(jié)合培育新品種。人工種子亦稱體細(xì)胞種子。早期的人工種子概念是：體細(xì)胞胚經(jīng)過人工種皮包被后而形成的體細(xì)胞種子。 現(xiàn)在指任何一種經(jīng)人工種皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖體均可稱之為人工種子。可將人工種子分為三大類： 裸露的或休眠的繁殖體 如微鱗莖，微塊莖等。它們在不加包被的情況下也具有較高的成株率。 人工種皮包被的繁殖體 一些體細(xì)胞胚、原球莖等不能過度干燥，但只需要用人工種皮包被即可維持良好的發(fā)芽狀態(tài)，如胡蘿卜體細(xì)胞胚。 水凝膠包埋再包被人工種皮的繁殖體 大多數(shù)體細(xì)胞胚、不定芽、莖尖等均需要先包埋在半液態(tài)凝膠中，再經(jīng)人工種皮包裹才能避免失水，從而維持良好的發(fā)芽能力。： 一類是體細(xì)胞胚人工種子； 另一類是非體細(xì)胞胚人工種子 在無性繁殖植物中，有可能建立一種高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品種的種性，又可以使之具有實生苗的復(fù)壯效應(yīng)； 可以對優(yōu)異雜種種子不通過有性制種而快速獲得大量種子，特別是對于那些制種困難的植物更具有主要的適用意義； 對于一些不能正常產(chǎn)生種子的特殊植物材料如三倍體、非整倍體、工程植物等，有可能通過人工種子在短期內(nèi)加大繁殖應(yīng)用； 與田間制種相比，可以節(jié)省制種用地，且不受季節(jié)限制，可以實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，同時還避免了種子攜帶病原菌的危險； 與利用試管苗相比，可以避免移栽困難，且可以實現(xiàn)機(jī)械化操作，同時還便于儲藏和運(yùn)輸。 這一技術(shù)不僅證實了細(xì)胞具有再生植株的“全能性”，而且對研究細(xì)胞生長、分化過程中的遺傳、生理、生化和代謝無疑有著重要意義。16. 體細(xì)胞胚規(guī)?；a(chǎn)的要求作為人工種子繁殖體的體細(xì)胞胚，其基本要求是要具有發(fā)育上的同步性，還必需滿足如下標(biāo)準(zhǔn)特征： 其一，形態(tài)正常，具有完整的胚結(jié)構(gòu)；其二，與母體植物的基因型基本相同，特別是在重要經(jīng)濟(jì)性狀和農(nóng)藝性狀上沒有變異； 其三，具有較好的成熟性，能耐一定程度的脫水。 其次，作為實用化的體細(xì)胞胚種子還必需滿足一定的數(shù)量需求，規(guī)?；a(chǎn)是其基本前提。 前處理繁殖體的處理體細(xì)胞胚形成后，需要在無激素培養(yǎng)基上經(jīng)過一定階段的后熟培養(yǎng)，然后進(jìn)行脫水干燥，再將畸形胚選出后才能進(jìn)行包埋。在脫水之前用ABA處理體細(xì)胞胚強(qiáng)迫其進(jìn)入休眠，更有利于長期貯存。 微型變態(tài)器官繁殖體不能過度脫水，但亦需要適當(dāng)干燥，除去表面及多余的水分，同時要進(jìn)行表面消毒處理以繁殖包被后的感染。為了延長貯存時間，亦需根據(jù)使用季節(jié)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男菝咛幚?。芽為繁殖體的類型，則不能進(jìn)行脫水處理，但必需篩選生長健壯、組織充實的芽進(jìn)行包埋。 18. 繁殖體的包埋介質(zhì)的要求： 首先必需是對繁殖體及其它生物是無毒的，并具有一定的緩沖強(qiáng)度，以保證繁殖體在生產(chǎn)、運(yùn)輸和種植操作中的安全。 同時，它最好能夠提供類似于胚乳的營養(yǎng)物質(zhì)，以供繁殖體發(fā)芽的需要。 此外由于繁殖體的含水量較高，貯存中極易受到微生物感染危害，因此介質(zhì)中還應(yīng)含有適當(dāng)?shù)臍⒕鷦?常用的兩種人工胚乳液配方MS（或SH、White）%的馬鈴薯淀粉水解物；SH（）%的麥芽糖。 19. 人工種子包埋程序以海藻酸鈉作包埋劑的操作程序是 在配制好的海藻酸鈉溶液中，按一定比例加入繁殖體并混勻。%%的CaCl2溶液中，經(jīng)20－。 20. 人工種皮裝配理想的人工種皮應(yīng)該是：具有一定的封閉性以保證人工胚乳的各種成分不易流失，同時又具有良好的透氣性，具有一定的堅硬度，以加強(qiáng)人工種子的耐儲運(yùn)性和適于機(jī)械化操作。 無毒無害，能保證繁殖體順利穿透發(fā)芽， 配制簡單易行，成本低。 常用的人工種皮材料 早期使用Elvax 4260涂膜，價格昂貴，操作復(fù)雜、包裹效果不盡人意。 新近試驗使用的二氧化硅化合物材料包括疏水的Tullanox和微親水的CabOSil，二者均可以粉末狀包裹在人工種子膠囊外層，操作時只需將膠囊在上述材料中滾動即可完成包被過程，操作簡單易行，大量生產(chǎn)還可以機(jī)械化操作。 最近還報道一種硅酮種衣，它不僅可以抗真菌，而且可滲入水蒸氣和氧氣，這些材料均還處于試驗之中。 第六章 植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生產(chǎn)物生產(chǎn) 細(xì)胞培養(yǎng)類型根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模:小規(guī)模培養(yǎng)和大批量培養(yǎng)； 根據(jù)培養(yǎng)方式:懸浮培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)； 根據(jù)要求產(chǎn)物:用于誘變的細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)次生產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)概念、特點(diǎn)、目的、制備 懸浮培養(yǎng)是將單個游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。 液體狀態(tài)下便于細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細(xì)胞狀態(tài)可以相對保持一致，因此有利于在細(xì)胞水平上進(jìn)行各種遺傳操作，生理生化活動的研究，同時為植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。 基本特點(diǎn)是從愈傷組織的液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種培養(yǎng)技術(shù)，主要有兩個基本特點(diǎn)：1．細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，適于大規(guī)模生產(chǎn)2．可以提供大量的比較均勻的細(xì)胞，為深入研究細(xì)胞的生長、分化創(chuàng)造了一種很好的實驗方法和條件；愈傷組織只能提供細(xì)胞間可能已明顯分化的細(xì)胞。但是，這種理想狀態(tài)不容易得到。到目前為止，還不能完全做到只有游離的單細(xì)胞，通常里面還有小細(xì)胞團(tuán)，這是由于植物細(xì)胞具有聚集在一起的特性。目的　 主要用于生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，所以保持細(xì)胞停留在增殖階段是十分重要的，細(xì)胞勿需繼續(xù)分化懸浮系的制備 將疏松的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過搖床不斷振動，使細(xì)胞分散。 一般來說，分散比較好的細(xì)胞懸浮物是由薄壁細(xì)胞組成的。但有時還存在一些木質(zhì)化的類管胞等成分，這些類管胞成分是引起細(xì)胞聚合的重要因素。通常適于愈傷組織生長的液體培養(yǎng)基也適用于同種植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。有時需要調(diào)節(jié)激素的濃度。懸浮培養(yǎng)對材料的要求 愈傷組織的要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎。 選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度；必要的附加物質(zhì)。懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個優(yōu)點(diǎn)： 一是增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)； 二是在振蕩條件下可避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對細(xì)胞自身產(chǎn)生毒害； 三是振蕩培養(yǎng)可以適當(dāng)改善氣體的交換一個成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件：懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30～50個細(xì)胞以下，在實際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般2～3天甚至更短時間便可增加一倍。 影響懸浮細(xì)胞生長的因素：起始愈傷組織的質(zhì)量；接種細(xì)胞密度：接種初期的細(xì)胞密度過低往往使延遲期加長，～105個細(xì)胞/毫升，低于這一密度則會使細(xì)胞生長延遲；培養(yǎng)條件：方式、溫度、繼代周期細(xì)胞同步化指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時通過細(xì)胞周期的某一特定時期。 植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中的游離性較差，容易團(tuán)聚并進(jìn)入不同程度的分化狀態(tài)，因此，要達(dá)到完全同步化對于植物細(xì)胞培養(yǎng)來講是十分困難的。 也正是因為同一培養(yǎng)體系的植物細(xì)胞通常并不能處于同一細(xì)胞周期，這種差異使懸浮細(xì)胞的分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等更趨復(fù)雜化。通過一定的理化措施可以使同一體系中的細(xì)胞達(dá)到相對同步化。饑餓法饑餓也是調(diào)整細(xì)胞同步化的方法之一。在一個培養(yǎng)體系中，如果細(xì)胞生長的基本成分喪失，則導(dǎo)致細(xì)胞因饑餓而分裂受阻，從而停留在某一分裂時期，當(dāng)在培養(yǎng)基中加入所缺乏的成分或者將饑餓細(xì)胞轉(zhuǎn)入完整培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)時，則細(xì)胞分裂又可重新恢復(fù)。 饑餓導(dǎo)致的細(xì)胞分裂受阻常常是使細(xì)胞不能合成DNA，即不能進(jìn)入S期，或細(xì)胞分裂不能進(jìn)行，即不能進(jìn)入M期。因此，通過饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化細(xì)胞。 抑制劑法通過一些DNA合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞滯留在DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期－G1期的同步化細(xì)胞。常用抑制主要有5－氟脫氧尿苷（5flouorodeoxyuridine，F(xiàn)udR）和羥基尿（hydoxyurea，HU）。 通過抑制劑獲得的同步化細(xì)胞基本處于同一個細(xì)胞周期，在除去抑制劑后可以不進(jìn)行分選直接培養(yǎng)，分選法通過細(xì)胞體積大小分級是直接將處于相同周期的細(xì)胞進(jìn)行分選，然后將同一狀態(tài)的細(xì)胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中，從而可能保持相同培養(yǎng)體系中的細(xì)胞具有較好的一致性。 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，不影響細(xì)胞活力。精細(xì)度較差。常規(guī)細(xì)胞分選定方法是采用梯度離心的方法。 低溫處理冷處理也可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度。Okamura等曾采用此途徑使胡蘿卜懸浮細(xì)胞較好的同步化。單細(xì)胞培養(yǎng)方法：（一）分離單細(xì)胞的方法1．物理方法：　　將疏松的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，經(jīng)搖床不斷振動，使細(xì)胞分散。若向細(xì)胞懸浮液中吹入脈沖壓縮氣體，細(xì)胞分散的更好。2．化學(xué)方法：胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中加入草酸鈣（100μg/L）得到較分散的細(xì)胞。因為草酸鹽能結(jié)合細(xì)胞間質(zhì)中果膠鈣的鈣離子。秋水仙素（）或2,4D或水解乳蛋白對細(xì)胞分散有一定的作用3．酶法：　　果膠酶和纖維素酶有利于細(xì)胞分離，但使用濃度不當(dāng)容易引起細(xì)胞降解。（二）單細(xì)胞的培養(yǎng)方法1．液體淺層培養(yǎng)：　　先將細(xì)胞制成一定密度的細(xì)胞懸浮液，用吸管將懸浮液移到培養(yǎng)皿中形成淺層，一般1mm左右，石蠟?zāi)し饪?，靜置培養(yǎng)?！　?yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)物與空氣接觸面大，通氣性好；細(xì)胞代謝產(chǎn)物容易擴(kuò)散，不會造成有害物質(zhì)的危害,繼代培養(yǎng)方便、便于觀察。　　缺點(diǎn)：由于細(xì)胞可以游動，不能進(jìn)行定點(diǎn)觀察2．微室培養(yǎng)（微滴培養(yǎng)）：40100μl　　優(yōu)點(diǎn)：可以連續(xù)觀察細(xì)胞的分化和發(fā)育；缺點(diǎn)：通氣性差。3．平板培養(yǎng)：　　優(yōu)點(diǎn)：便于定點(diǎn)觀察；缺點(diǎn)：通氣性較差4．看護(hù)培養(yǎng)；適用于難于培養(yǎng)的植物種類（三）培養(yǎng)細(xì)胞的密度及生活率的測定1．起始密度的測定：起始密度一般為104108個/ml 用記數(shù)板統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)目2．植板率的測定：　 用平板培養(yǎng)的需要統(tǒng)計植板率，即每個平板接種細(xì)胞總數(shù)中形成細(xì)胞團(tuán)的百分?jǐn)?shù)。（四）植株再生 獲得了細(xì)胞團(tuán)以后繼續(xù)培養(yǎng)形成愈傷組織 將大塊的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上再生植株。1單細(xì)胞培養(yǎng)方法細(xì)胞平板培養(yǎng) 所謂平板培養(yǎng)（plating culture）是指將一定密度的懸浮細(xì)胞接種到一薄層固體體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。 平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比例。 看護(hù)培養(yǎng) 看護(hù)培養(yǎng)（nurse culture）技術(shù)首先是有Muir等（1954）設(shè)計的，其操作方法是在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長的愈傷組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙濕潤后將細(xì)胞接種于濾紙上。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長出微小細(xì)胞團(tuán)以后，將其直接轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長。 微室培養(yǎng) 微室培養(yǎng)（microchamber culture）是為進(jìn)行單細(xì)胞活體連續(xù)觀察而建立的單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，運(yùn)用這種技術(shù)可對單細(xì)胞的生長與分化、細(xì)胞分裂的全過程、胞質(zhì)環(huán)流的規(guī)律等進(jìn)行活體連續(xù)觀察。這一方法同樣也可用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，用于觀察細(xì)胞壁的再生與細(xì)胞分裂過程。微室培養(yǎng)是細(xì)胞學(xué)研究的優(yōu)良實驗體系。.雙層濾紙植板培養(yǎng) Horsch等（1980）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法，該方法是在培養(yǎng)皿中倒入瓊脂培養(yǎng)基凝固后，先將飼養(yǎng)細(xì)胞平鋪在培養(yǎng)基上，然后在飼養(yǎng)細(xì)胞層上平展一張濾紙形成看護(hù)層，再將濾紙制成的圓碟置于看護(hù)層上，然后將培養(yǎng)細(xì)胞植于其中1植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的技術(shù)要求 從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物細(xì)胞生長和生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)； 從培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下三個條件：培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物；細(xì)胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物；代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。種子細(xì)胞選擇種子細(xì)胞增殖與放大培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)體系建立2種子細(xì)胞選擇（外植體選擇、高產(chǎn)細(xì)胞選擇）植物類型：植物細(xì)胞的遺傳基礎(chǔ)是天然產(chǎn)物生產(chǎn)的基本影響因素，不同植物產(chǎn)生的天然產(chǎn)物種類之所以不同，從根本上來說是因為它們具有不同的遺傳基礎(chǔ)。在確定生產(chǎn)某一種化合物以后，首先必須準(zhǔn)確選擇那些能夠產(chǎn)生目的化合物的植物種類及其品種或單株。 組織器官：由于天然產(chǎn)物一般為次生代謝產(chǎn)物，而植物次生代謝產(chǎn)物的積累具有組織器官特異性，因此，在起始細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官、組織為外植體。 在大多數(shù)情況下，來自起始材料的細(xì)胞系通常是一個異質(zhì)細(xì)胞群體，細(xì)胞間在次生產(chǎn)物積累能力上有很大差異。 為了提高篩選效率，還