【正文】 本技術(shù)原理1. 基 本 實(shí) 驗(yàn) 室設(shè)計(jì)準(zhǔn)備室 進(jìn)行藥品的保存、配置、消毒、分裝等。外設(shè)緩沖間—。B5含較高硝酸鹽、較低的銨鹽，較高的VB1，用于細(xì)胞懸浮和原生質(zhì)、葡萄、豆科植物的培養(yǎng)。 氨基酸細(xì)胞原生質(zhì)培養(yǎng)特別需要，水解酪蛋白， 激素細(xì)胞分裂素BA（6－芐基酰嘌呤）、KT（激動(dòng)素，糠基酰嘌呤）、ZT（玉米素）、2iP（異戊烯酰嘌呤，IAA，NAA，赤霉素：GA3，乙烯及乙烯抑制瓊脂 、卡拉膠固體培養(yǎng)活性炭 防止外植體變褐附加復(fù)合成分椰子汁、酵母提取液5. 培養(yǎng)基的固化劑有哪些，作用是什么?　　瓊脂、Gelrite、塑料泡膜、玻璃絲、巖棉、玻璃珠、Gala膠。11. 植物材料內(nèi)部帶菌處理方法。木本植物消毒在樹木冬季休眠期采取休眠枝條，經(jīng)滅菌后放于24冰箱冷藏4050天，以破除休眠；然后取出枝條再經(jīng)滅菌，放入4050 溫水中（無(wú)菌水），在溫室中進(jìn)行溫浴24小時(shí)；再浸泡在含有細(xì)胞分裂素和赤霉素的水溶液中，在30 溫室中及連續(xù)光照下催芽，當(dāng)枝條長(zhǎng)到68厘米是即可采取常規(guī)消毒方法取莖芽切段進(jìn)行離體培養(yǎng)， 植物因素：基因型，植物年齡，組織和器官的年齡，植物的生理狀態(tài)，取材年份及生長(zhǎng)條件，取材部位及大小。 對(duì)大多數(shù)植物組織20～28℃即可滿足生長(zhǎng)所需，其中26～27℃最適合。第二章 細(xì)胞全能性與形態(tài)發(fā)生〔totipotency〕概念指每個(gè)植物細(xì)胞都具有形成完整植株的能力，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞都具有全套的遺傳基因，無(wú)論是性細(xì)胞還是體細(xì)胞在特定條件下可以進(jìn)行表達(dá)。再分化〔redifferentiation〕:脫分化后具有分生能力的細(xì)胞再經(jīng)過(guò)與原來(lái)相同的分化過(guò)程，重新形成各類組織和器官的過(guò)程。 植物激素是離體培養(yǎng)中所必需的條件，因此與植物激素相關(guān)的基因表達(dá)被認(rèn)為是啟動(dòng)細(xì)胞脫分化的關(guān)鍵。 影響脫分化和再分化的因素 激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素，其中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是兩類主要的調(diào)控培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的植物激素。⒊直接分化根，再分化芽。從莖尖或頂端分生組織中誘導(dǎo)。 一、二年生無(wú)性繁殖植物的取材則可塑性較大，但仍以自然繁殖器官為外植體更易成功。直接胚狀體發(fā)生細(xì)胞胚從外植體上直接產(chǎn)生。胚狀體異常現(xiàn)象單片子葉；多子葉；杯狀胚狀體；柱狀胚狀體。亞原生質(zhì)體：在原生質(zhì)體分離過(guò)程中，有時(shí)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)含物的斷裂而形成一些較小的原生質(zhì)體就叫做亞原生質(zhì)體。1880年，Hanstein首次起用原生質(zhì)體(protoplast)一詞。培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)處理?xiàng)l件：在游離原生質(zhì)體前對(duì)供體材料進(jìn)行預(yù)處理及預(yù)培養(yǎng)，可以提高某些材料原生質(zhì)體的活力和分裂頻率。FDA法：FDA（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，能自由地穿越細(xì)胞質(zhì)膜，在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過(guò)質(zhì)膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過(guò)具熒光的細(xì)胞的觀察確定細(xì)胞活性。此外，難以跟蹤觀察某一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育情況。 優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。一般原生質(zhì)體培養(yǎng)2～7 d后開始第一次分裂，但開始第一次分裂的時(shí)間隨植物的種類、分離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異。 融合過(guò)程不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。其缺點(diǎn)是融合過(guò)程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。 關(guān)于融合參數(shù)交流電壓、交變電場(chǎng)的振幅頻率、交變電場(chǎng)的處理時(shí)間、直流高頻電壓、脈沖寬度、 脈沖次數(shù) 1影響原生質(zhì)體融合的因素 分子鑒定：RFLP鑒定、RAPD標(biāo)記鑒定。單倍體植物有單倍體細(xì)胞產(chǎn)生的植株。 用作基礎(chǔ)遺傳研究的各個(gè)領(lǐng)域草本植物生長(zhǎng)健壯、且處于生殖生長(zhǎng)高峰期的花藥誘導(dǎo)頻率高，徒長(zhǎng)或營(yíng)養(yǎng)不足的植株花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)頻率低?！７至殉梢粋€(gè)生殖核、一個(gè)營(yíng)養(yǎng)核。不正常的非單倍體花粉產(chǎn)生的植株?！　　　　∩L(zhǎng)點(diǎn)處理：～%秋水仙素和羊毛脂（3：2）涂抹。雙層培養(yǎng) 先在培養(yǎng)皿中鋪上固體培養(yǎng)基，凝固后在其上接種花粉懸浮液。培養(yǎng)方式：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)。除葡萄外，在禾本科以外的植物花藥培養(yǎng)中尚未發(fā)現(xiàn)白化苗。 根據(jù)在培養(yǎng)中所取的外植體的部位不同，植物胚胎培養(yǎng)包括胚培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)。22. 生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素在胚胎培養(yǎng)中的作用。 胚性發(fā)育幼胚接種到培養(yǎng)基上以后，仍然按照在活體內(nèi)的發(fā)育方式發(fā)育，最后形成成熟胚(有時(shí)甚至可能類似種子)，然后再按種子萌發(fā)途徑出苗形成完整植株，這種途徑發(fā)育的幼胚一般一個(gè)幼胚將來(lái)就是一個(gè)植株。初生胚乳核第一次分裂為細(xì)胞型，以后兩個(gè)細(xì)胞中的核進(jìn)行游離核分裂。 嵌合性是指同一有機(jī)體中同時(shí)存在有遺傳組成不同的細(xì)胞，它是組織培養(yǎng)中常見的現(xiàn)象。普遍認(rèn)為，培養(yǎng)方式、激素以及其它附加成分均會(huì)誘導(dǎo)體細(xì)胞變異的發(fā)生，因?yàn)殡x體培養(yǎng)本身可能即是一種變異誘導(dǎo)的過(guò)程。 由繼代次數(shù)引起的體細(xì)胞變異幾乎在各種類型的植物中均有報(bào)道。紡錘體形成異常使得有絲分裂不正常是其原因之一。 轉(zhuǎn)座子活化上個(gè)世紀(jì)80年代，Larkin和Scowcroft首先提出，轉(zhuǎn)座因子的活化可能是體細(xì)胞無(wú)性系變異的原因之一。誘變起始材料的選擇選擇起始材料需考慮以下幾方面的問(wèn)題: 其一，目標(biāo)性狀的可行性。特別是以原生質(zhì)體為誘導(dǎo)材料時(shí)，可以使用紫外線照射，因?yàn)槌Ｓ米贤饩€的波長(zhǎng)為270nm，與DNA吸收波長(zhǎng)260nm相近，而原生質(zhì)體因?yàn)闆]有細(xì)胞壁的屏障，對(duì)紫外線的敏感性較強(qiáng)，從而可以達(dá)到較好的誘變效果。 間接選擇間接選擇法是一種借助于與突變表現(xiàn)型有關(guān)的性狀作為選擇指標(biāo)的篩選方法。我們可以根據(jù)需要建立某一代謝途徑中每一個(gè)調(diào)節(jié)點(diǎn)的突變體，也可以根據(jù)需要與基因工程相結(jié)合，對(duì)一些關(guān)鍵調(diào)控過(guò)程進(jìn)行修飾和改造，使代謝過(guò)程按照人類需要進(jìn)行。 如葉片上產(chǎn)生。其特點(diǎn)是成功率高，繁殖系數(shù)大，但遺傳穩(wěn)定性較差。試管外生根也可將未生根的試管苗直接入土生根，入土前可使用促根劑處理提高成活率，這種做法可大幅度降低生產(chǎn)成本6. 影響根分化的因素培養(yǎng)基的成分：基本培養(yǎng)基、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素培養(yǎng)基條件：光經(jīng)常抑制根生長(zhǎng)、溫度　21－30均可誘導(dǎo)生根　　　組培苗的移栽生根或形成根原基的試管苗從無(wú)菌，溫、光、濕度穩(wěn)定環(huán)境中進(jìn)入到自然環(huán)境中，試管苗葉面蠟質(zhì)少，易失水，從異養(yǎng)過(guò)渡到自養(yǎng)過(guò)程，必須經(jīng)過(guò)一個(gè)煉苗過(guò)程。培養(yǎng)基種類和成分細(xì)胞分裂素易導(dǎo)致玻璃化，MS《B5培養(yǎng)條件弱光下、瓶口密封較嚴(yán)、高溫、相對(duì)濕度高、瓊脂濃度低玻璃化高，解決途徑：改善通氣條件降溫（〈32）、透氣、減小接種密度、增大培養(yǎng)容器體積。⒈及時(shí)發(fā)現(xiàn)撥除變異植株。 水凝膠包埋再包被人工種皮的繁殖體 大多數(shù)體細(xì)胞胚、不定芽、莖尖等均需要先包埋在半液態(tài)凝膠中，再經(jīng)人工種皮包裹才能避免失水，從而維持良好的發(fā)芽能力。為了延長(zhǎng)貯存時(shí)間，亦需根據(jù)使用季節(jié)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男菝咛幚怼?20. 人工種皮裝配理想的人工種皮應(yīng)該是：具有一定的封閉性以保證人工胚乳的各種成分不易流失，同時(shí)又具有良好的透氣性，具有一定的堅(jiān)硬度，以加強(qiáng)人工種子的耐儲(chǔ)運(yùn)性和適于機(jī)械化操作。 基本特點(diǎn)是從愈傷組織的液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種培養(yǎng)技術(shù)，主要有兩個(gè)基本特點(diǎn)：但有時(shí)還存在一些木質(zhì)化的類管胞等成分，這些類管胞成分是引起細(xì)胞聚合的重要因素。懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個(gè)優(yōu)點(diǎn)： 一是增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)； 二是在振蕩條件下可避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對(duì)細(xì)胞自身產(chǎn)生毒害； 三是振蕩培養(yǎng)可以適當(dāng)改善氣體的交換一個(gè)成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個(gè)條件：懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30～50個(gè)細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。培養(yǎng)條件：方式、溫度、繼代周期細(xì)胞同步化指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。 抑制劑法通過(guò)一些DNA合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞滯留在DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期－G1期的同步化細(xì)胞。單細(xì)胞培養(yǎng)方法：（一）分離單細(xì)胞的方法秋水仙素（）或2,4D或水解乳蛋白對(duì)細(xì)胞分散有一定的作用3．平板培養(yǎng)：　　優(yōu)點(diǎn)：便于定點(diǎn)觀察；缺點(diǎn)：通氣性較差（四）植株再生 .雙層濾紙植板培養(yǎng) Horsch等（1980）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法，該方法是在培養(yǎng)皿中倒入瓊脂培養(yǎng)基凝固后，先將飼養(yǎng)細(xì)胞平鋪在培養(yǎng)基上，然后在飼養(yǎng)細(xì)胞層上平展一張濾紙形成看護(hù)層，再將濾紙制成的圓碟置于看護(hù)層上，然后將培養(yǎng)細(xì)胞植于其中1植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的技術(shù)要求 在大多數(shù)情況下，來(lái)自起始材料的細(xì)胞系通常是一個(gè)異質(zhì)細(xì)胞群體，細(xì)胞間在次生產(chǎn)物積累能力上有很大差異。植板率是能長(zhǎng)出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比例。 1．起始密度的測(cè)定：起始密度一般為104108個(gè)/ml（二）單細(xì)胞的培養(yǎng)方法若向細(xì)胞懸浮液中吹入脈沖壓縮氣體，細(xì)胞分散的更好。 通過(guò)抑制劑獲得的同步化細(xì)胞基本處于同一個(gè)細(xì)胞周期，在除去抑制劑后可以不進(jìn)行分選直接培養(yǎng)，分選法通過(guò)細(xì)胞體積大小分級(jí)是直接將處于相同周期的細(xì)胞進(jìn)行分選，然后將同一狀態(tài)的細(xì)胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中，從而可能保持相同培養(yǎng)體系中的細(xì)胞具有較好的一致性。 也正是因?yàn)橥慌囵B(yǎng)體系的植物細(xì)胞通常并不能處于同一細(xì)胞周期，這種差異使懸浮細(xì)胞的分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等更趨復(fù)雜化。均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。有時(shí)需要調(diào)節(jié)激素的濃度。2．可以提供大量的比較均勻的細(xì)胞，為深入研究細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化創(chuàng)造了一種很好的實(shí)驗(yàn)方法和條件；愈傷組織只能提供細(xì)胞間可能已明顯分化的細(xì)胞。 常用的人工種皮材料 早期使用Elvax 4260涂膜，價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜、包裹效果不盡人意。 18. 繁殖體的包埋介質(zhì)的要求： 首先必需是對(duì)繁殖體及其它生物是無(wú)毒的，并具有一定的緩沖強(qiáng)度，以保證繁殖體在生產(chǎn)、運(yùn)輸和種植操作中的安全。 這一技術(shù)不僅證實(shí)了細(xì)胞具有再生植株的“全能性”，而且對(duì)研究細(xì)胞生長(zhǎng)、分化過(guò)程中的遺傳、生理、生化和代謝無(wú)疑有著重要意義。人工種子亦稱體細(xì)胞種子。 本 原 理病毒在植物體內(nèi)的分布具有不均勻性：病毒在根系內(nèi)的不同區(qū)域分布是不均勻的，越靠根尖區(qū)病毒含量越低，在根尖分生組織區(qū)(生長(zhǎng)點(diǎn))的頂端不含病毒。具體做法：首先打開試管瓶塞放陽(yáng)光充足處讓其鍛煉1～2天，然后取出幼苗用溫水將瓊脂沖洗掉，移栽到泥炭、珍珠巖、蛭石、礱糠灰等組成的基質(zhì)（透氣保濕）中，基質(zhì)使用前需高溫消毒，移栽后要適當(dāng)遮蔭，可用塑料薄膜覆蓋，保持較高空氣濕度，溫度維持在25℃左右，勿使陽(yáng)光直曬，7～10天后要注意通風(fēng)和補(bǔ)充澆水，約20～40天，新梢開始生長(zhǎng)后，小苗可轉(zhuǎn)入正常管理玻璃化現(xiàn)象整株矮小腫脹，莖葉透明或半透明，葉片皺縮或縱向卷曲，葉質(zhì)脆且厚，組織呈水浸狀，葉表面缺少角質(zhì)層或蠟質(zhì)發(fā)育不全。理論上，一個(gè)芽(或其它外植體)在一定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)于增殖培養(yǎng)基上形成的芽總數(shù)為這種植物無(wú)性快繁的繁殖系數(shù)。 但繼代次數(shù)有限。 第六章 試管繁殖是在人工控制的無(wú)菌條件下，使植物在人工培養(yǎng)基上繁殖的技術(shù)。 遺傳學(xué)研究突變體直接用于基因功能鑒定，突變DNA序列用作分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳研究 發(fā)育生物學(xué)研究利用體細(xì)胞突變策略對(duì)植物發(fā)育的基因調(diào)控研究已在模式植物擬南芥和金魚草等植物中廣泛開展，并分離出一大批不同發(fā)育階段和組織類型的突變體，包括頂端分生組織、根、開花轉(zhuǎn)變、花序、花分生組織、胚胎發(fā)育等的系列突變體。 此外亞硝酸、羥胺等某些抗菌素等亦可引起突變產(chǎn)生。 其二，必需充分考慮試驗(yàn)植物的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)水平。DNA甲基化和去甲基化，不僅能通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)與關(guān)閉來(lái)控制生物的發(fā)育，同時(shí)也可以通過(guò)DNA甲基化途徑來(lái)適應(yīng)環(huán)境對(duì)生物體的壓力。體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ) 基因水平上的變異從根本上講就是DNA水平上的堿基突變或修飾狀態(tài)的改變。 體細(xì)胞變異的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ) DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制 DNA重復(fù)復(fù)制但不發(fā)生細(xì)胞分裂，其結(jié)果是染色體組數(shù)增加，形成同源多倍體。激素除了引起染色體倍性的增加外，在一些培養(yǎng)中還發(fā)現(xiàn)染色體倍性減少的現(xiàn)象。 影響體細(xì)胞遺傳與變異的因素供體植物的遺傳背景對(duì)體細(xì)胞變異具有直接影響。體細(xì)胞無(wú)性系變異由任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株所表現(xiàn)出來(lái)的變異。核型胚乳 胚乳最初發(fā)育經(jīng)過(guò)一段游離核階段，絕大多數(shù)被子植物的胚乳屬于核型胚乳。在大多數(shù)情況下，一個(gè)幼胚萌發(fā)成一個(gè)植株，但有時(shí)會(huì)由于細(xì)胞分裂產(chǎn)生大量的胚性細(xì)胞，以后形成許多胚狀體，從而可以形成許多植株，這種現(xiàn)象就是所謂的叢生胚現(xiàn)象。以幼胚搶救為目的的胚培養(yǎng)取材，必須在胚退化衰敗之前。⒉細(xì)胞分裂素在有的植物上抑制胚生長(zhǎng)，而有些植物可促進(jìn)胚發(fā)育。 培養(yǎng)基對(duì)花粉白苗形成的影響主要在愈傷組織發(fā)生階段，受分化培養(yǎng)基的影響較小。 禾谷類植物的花粉愈傷組織在器官分化時(shí)，葉綠體的發(fā)育一般是和芽組織的分化同時(shí)進(jìn)行的，由愈傷組織上芽點(diǎn)的顏色可以判斷分化出來(lái)的將是綠苗或是白苗。固體培養(yǎng)基滅菌后在凝固前加入到滅菌過(guò)的6cm培養(yǎng)皿中，每皿鋪約2mm厚，等完全凝固后，在其上層接種密度為1104的花粉懸浮液，接種量以1mm厚的液層為宜。一是機(jī)械擠壓梯度離心法 此方法是將花藥消毒后，用鑷子或小玻