【正文】 試管苗從無菌，溫、光、濕度穩(wěn)定環(huán)境中進(jìn)入到自然環(huán)境中，試管苗葉面蠟質(zhì)少，易失水，從異養(yǎng)過渡到自養(yǎng)過程，必須經(jīng)過一個(gè)煉苗過程。失去增殖和生根能力。培養(yǎng)基種類和成分細(xì)胞分裂素易導(dǎo)致玻璃化，MS《B5培養(yǎng)條件弱光下、瓶口密封較嚴(yán)、高溫、相對(duì)濕度高、瓊脂濃度低玻璃化高，解決途徑：改善通氣條件降溫（〈32）、透氣、減小接種密度、增大培養(yǎng)容器體積。 生長競(jìng)爭(zhēng)學(xué)說的基本內(nèi)容：植物細(xì)胞同病毒之間有相互競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系，在莖尖分生組織區(qū)植物細(xì)胞合成代謝旺盛，細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞的正常核蛋白的合成占優(yōu)勢(shì)，病毒競(jìng)爭(zhēng)不到營養(yǎng)無法自身繁殖，而在細(xì)胞伸長期間病毒蛋白合成就可以占優(yōu)勢(shì)，造成病毒蔓延。⒈及時(shí)發(fā)現(xiàn)撥除變異植株。 現(xiàn)在指任何一種經(jīng)人工種皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖體均可稱之為人工種子。 水凝膠包埋再包被人工種皮的繁殖體 大多數(shù)體細(xì)胞胚、不定芽、莖尖等均需要先包埋在半液態(tài)凝膠中，再經(jīng)人工種皮包裹才能避免失水，從而維持良好的發(fā)芽能力。 其次，作為實(shí)用化的體細(xì)胞胚種子還必需滿足一定的數(shù)量需求，規(guī)?；a(chǎn)是其基本前提。為了延長貯存時(shí)間，亦需根據(jù)使用季節(jié)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男菝咛幚怼?此外由于繁殖體的含水量較高，貯存中極易受到微生物感染危害，因此介質(zhì)中還應(yīng)含有適當(dāng)?shù)臍⒕鷦?20. 人工種皮裝配理想的人工種皮應(yīng)該是：具有一定的封閉性以保證人工胚乳的各種成分不易流失，同時(shí)又具有良好的透氣性，具有一定的堅(jiān)硬度，以加強(qiáng)人工種子的耐儲(chǔ)運(yùn)性和適于機(jī)械化操作。 最近還報(bào)道一種硅酮種衣，它不僅可以抗真菌，而且可滲入水蒸氣和氧氣，這些材料均還處于試驗(yàn)之中。 基本特點(diǎn)是從愈傷組織的液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種培養(yǎng)技術(shù)，主要有兩個(gè)基本特點(diǎn)：到目前為止，還不能完全做到只有游離的單細(xì)胞，通常里面還有小細(xì)胞團(tuán)，這是由于植物細(xì)胞具有聚集在一起的特性。但有時(shí)還存在一些木質(zhì)化的類管胞等成分，這些類管胞成分是引起細(xì)胞聚合的重要因素。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎。懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個(gè)優(yōu)點(diǎn)： 一是增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)； 二是在振蕩條件下可避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對(duì)細(xì)胞自身產(chǎn)生毒害； 三是振蕩培養(yǎng)可以適當(dāng)改善氣體的交換一個(gè)成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個(gè)條件：懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30～50個(gè)細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般2～3天甚至更短時(shí)間便可增加一倍。培養(yǎng)條件：方式、溫度、繼代周期細(xì)胞同步化指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。饑餓法饑餓也是調(diào)整細(xì)胞同步化的方法之一。 抑制劑法通過一些DNA合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞滯留在DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期－G1期的同步化細(xì)胞。精細(xì)度較差。單細(xì)胞培養(yǎng)方法：（一）分離單細(xì)胞的方法2．化學(xué)方法：秋水仙素（）或2,4D或水解乳蛋白對(duì)細(xì)胞分散有一定的作用　　優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)物與空氣接觸面大，通氣性好；細(xì)胞代謝產(chǎn)物容易擴(kuò)散，不會(huì)造成有害物質(zhì)的危害,繼代培養(yǎng)方便、便于觀察。3．平板培養(yǎng)：　　優(yōu)點(diǎn)：便于定點(diǎn)觀察；缺點(diǎn)：通氣性較差（四）植株再生 當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長出微小細(xì)胞團(tuán)以后，將其直接轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長。.雙層濾紙植板培養(yǎng) Horsch等（1980）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法，該方法是在培養(yǎng)皿中倒入瓊脂培養(yǎng)基凝固后，先將飼養(yǎng)細(xì)胞平鋪在培養(yǎng)基上，然后在飼養(yǎng)細(xì)胞層上平展一張濾紙形成看護(hù)層，再將濾紙制成的圓碟置于看護(hù)層上，然后將培養(yǎng)細(xì)胞植于其中1植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的技術(shù)要求 從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物細(xì)胞生長和生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)； 從培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下三個(gè)條件：培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物；細(xì)胞生長及生物合成的速度快，在較短的時(shí)間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物；代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。 在大多數(shù)情況下，來自起始材料的細(xì)胞系通常是一個(gè)異質(zhì)細(xì)胞群體，細(xì)胞間在次生產(chǎn)物積累能力上有很大差異。在確定生產(chǎn)某一種化合物以后，首先必須準(zhǔn)確選擇那些能夠產(chǎn)生目的化合物的植物種類及其品種或單株。這一方法同樣也可用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，用于觀察細(xì)胞壁的再生與細(xì)胞分裂過程。植板率是能長出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比例。 將大塊的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上再生植株。 2．植板率的測(cè)定：　 1．起始密度的測(cè)定：起始密度一般為104108個(gè)/ml2．微室培養(yǎng)（微滴培養(yǎng)）：40100μl　　優(yōu)點(diǎn)：可以連續(xù)觀察細(xì)胞的分化和發(fā)育；缺點(diǎn)：通氣性差。（二）單細(xì)胞的培養(yǎng)方法因?yàn)椴菟猁}能結(jié)合細(xì)胞間質(zhì)中果膠鈣的鈣離子。若向細(xì)胞懸浮液中吹入脈沖壓縮氣體，細(xì)胞分散的更好。 低溫處理冷處理也可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度。 通過抑制劑獲得的同步化細(xì)胞基本處于同一個(gè)細(xì)胞周期，在除去抑制劑后可以不進(jìn)行分選直接培養(yǎng)，分選法通過細(xì)胞體積大小分級(jí)是直接將處于相同周期的細(xì)胞進(jìn)行分選，然后將同一狀態(tài)的細(xì)胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中，從而可能保持相同培養(yǎng)體系中的細(xì)胞具有較好的一致性。 饑餓導(dǎo)致的細(xì)胞分裂受阻常常是使細(xì)胞不能合成DNA，即不能進(jìn)入S期，或細(xì)胞分裂不能進(jìn)行，即不能進(jìn)入M期。 也正是因?yàn)橥慌囵B(yǎng)體系的植物細(xì)胞通常并不能處于同一細(xì)胞周期，這種差異使懸浮細(xì)胞的分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等更趨復(fù)雜化。起始愈傷組織的質(zhì)量；均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。有時(shí)需要調(diào)節(jié)激素的濃度。 將疏松的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過搖床不斷振動(dòng)，使細(xì)胞分散。2．可以提供大量的比較均勻的細(xì)胞，為深入研究細(xì)胞的生長、分化創(chuàng)造了一種很好的實(shí)驗(yàn)方法和條件；愈傷組織只能提供細(xì)胞間可能已明顯分化的細(xì)胞。懸浮培養(yǎng)概念、特點(diǎn)、目的、制備 懸浮培養(yǎng)是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。 常用的人工種皮材料 早期使用Elvax 4260涂膜，價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜、包裹效果不盡人意。 19. 人工種子包埋程序以海藻酸鈉作包埋劑的操作程序是 在配制好的海藻酸鈉溶液中，按一定比例加入繁殖體并混勻。 18. 繁殖體的包埋介質(zhì)的要求： 首先必需是對(duì)繁殖體及其它生物是無毒的，并具有一定的緩沖強(qiáng)度，以保證繁殖體在生產(chǎn)、運(yùn)輸和種植操作中的安全。在脫水之前用ABA處理體細(xì)胞胚強(qiáng)迫其進(jìn)入休眠，更有利于長期貯存。 這一技術(shù)不僅證實(shí)了細(xì)胞具有再生植株的“全能性”，而且對(duì)研究細(xì)胞生長、分化過程中的遺傳、生理、生化和代謝無疑有著重要意義。它們?cè)诓患影坏那闆r下也具有較高的成株率。人工種子亦稱體細(xì)胞種子。血清鑒定(serologic test) 試管沉淀反應(yīng)；免疫雙擴(kuò)散；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA：利用抗體抗原反應(yīng)，將病毒制成抗體，再生植株葉片為抗原。 本 原 理病毒在植物體內(nèi)的分布具有不均勻性：病毒在根系內(nèi)的不同區(qū)域分布是不均勻的，越靠根尖區(qū)病毒含量越低，在根尖分生組織區(qū)(生長點(diǎn))的頂端不含病毒。產(chǎn)生因素：外植體種類與基因型有關(guān)，有些材料無論在什么條件下都不出現(xiàn)。具體做法：首先打開試管瓶塞放陽光充足處讓其鍛煉1～2天，然后取出幼苗用溫水將瓊脂沖洗掉，移栽到泥炭、珍珠巖、蛭石、礱糠灰等組成的基質(zhì)（透氣保濕）中，基質(zhì)使用前需高溫消毒，移栽后要適當(dāng)遮蔭，可用塑料薄膜覆蓋，保持較高空氣濕度，溫度維持在25℃左右，勿使陽光直曬，7～10天后要注意通風(fēng)和補(bǔ)充澆水，約20～40天，新梢開始生長后，小苗可轉(zhuǎn)入正常管理玻璃化現(xiàn)象整株矮小腫脹，莖葉透明或半透明，葉片皺縮或縱向卷曲，葉質(zhì)脆且厚，組織呈水浸狀，葉表面缺少角質(zhì)層或蠟質(zhì)發(fā)育不全。一般應(yīng)用1／2MS培養(yǎng)基，提高生長素的濃度，具體應(yīng)根據(jù)植物不同而定。理論上，一個(gè)芽(或其它外植體)在一定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)于增殖培養(yǎng)基上形成的芽總數(shù)為這種植物無性快繁的繁殖系數(shù)。這一途徑經(jīng)歷了組織培養(yǎng)技術(shù)的所有過程(愈傷組織誘導(dǎo)－愈傷組織增殖－芽分化－生根－完整植株)，它屬于真正意義上的組織培養(yǎng)。 但繼代次數(shù)有限。這一繁殖方式一般不需要添加外源激素，如果某些植物需要使用激素（BA)，一定要嚴(yán)格控制濃度，以防止產(chǎn)生愈傷組織。 第六章 試管繁殖是在人工控制的無菌條件下，使植物在人工培養(yǎng)基上繁殖的技術(shù)。代謝途徑研究突變體作為代謝活動(dòng)調(diào)控研究的工具，具有十分便利和高效的優(yōu)勢(shì)。 遺傳學(xué)研究突變體直接用于基因功能鑒定，突變DNA序列用作分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳研究 發(fā)育生物學(xué)研究利用體細(xì)胞突變策略對(duì)植物發(fā)育的基因調(diào)控研究已在模式植物擬南芥和金魚草等植物中廣泛開展，并分離出一大批不同發(fā)育階段和組織類型的突變體，包括頂端分生組織、根、開花轉(zhuǎn)變、花序、花分生組織、胚胎發(fā)育等的系列突變體。如抗除草劑、抗鹽堿突變體的篩選，均可直接在培養(yǎng)基中加入一定濃度的除草劑或增加滲透壓的物質(zhì)。 此外亞硝酸、羥胺等某些抗菌素等亦可引起突變產(chǎn)生。以組織器官為誘導(dǎo)材料，可以選擇輻射強(qiáng)度較大的γ射線、快中子等進(jìn)行輻射。 其二，必需充分考慮試驗(yàn)植物的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)水平。 由于變異是在單細(xì)胞水平上進(jìn)行的，因此，一個(gè)突變體就是來自一個(gè)細(xì)胞，不會(huì)有非突變細(xì)胞的干擾，避免了整體植株水平上無性變異常呈現(xiàn)出的嵌合體。DNA甲基化和去甲基化，不僅能通過調(diào)控基因的表達(dá)與關(guān)閉來控制生物的發(fā)育，同時(shí)也可以通過DNA甲基化途徑來適應(yīng)環(huán)境對(duì)生物體的壓力。對(duì)于單基因控制的遺傳性狀，大多數(shù)堿基突變可以穩(wěn)定遺傳而且符合孟德爾遺傳分離規(guī)律，植物的許多性狀特別是經(jīng)濟(jì)性狀均由多基因控制，對(duì)于多基因控制性狀的堿基突變可能由于技術(shù)上的復(fù)雜性，目前還沒有關(guān)于多基因控制性狀的堿基突變報(bào)道。體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ) 基因水平上的變異從根本上講就是DNA水平上的堿基突變或修飾狀態(tài)的改變。 產(chǎn)生染色體結(jié)構(gòu)變異的再生植株一般生長不正常，生活力低下，很難長期生存，因此以保存種質(zhì)資源為目的的離體培養(yǎng)應(yīng)盡可能避免這種變異發(fā)生，以免造成基因資源流失。 體細(xì)胞變異的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ) DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制 DNA重復(fù)復(fù)制但不發(fā)生細(xì)胞分裂，其結(jié)果是染色體組數(shù)增加，形成同源多倍體。在細(xì)胞培養(yǎng)中，性細(xì)胞培養(yǎng)再生植株的變異要大于體細(xì)胞培養(yǎng)的植株。激素除了引起染色體倍性的增加外，在一些培養(yǎng)中還發(fā)現(xiàn)染色體倍性減少的現(xiàn)象。 在分化組織中，由于細(xì)胞分化過程中的核內(nèi)有絲分裂或核內(nèi)復(fù)制，其結(jié)果是在活體內(nèi)組織分化期間就會(huì)出現(xiàn)體細(xì)胞多倍性。 影響體細(xì)胞遺傳與變異的因素供體植物的遺傳背景對(duì)體細(xì)胞變異具有直接影響。 從生理生化特性上看容易出現(xiàn)同功酶譜、次生代謝的消長等變異。體細(xì)胞無性系變異由任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株所表現(xiàn)出來的變異。某些合瓣花植物，如煙草、芝麻、以及番茄等是屬于次類。核型胚乳 胚乳最初發(fā)育經(jīng)過一段游離核階段，絕大多數(shù)被子植物的胚乳屬于核型胚乳。裸子植物胚乳在受精前就已形成。在大多數(shù)情況下，一個(gè)幼胚萌發(fā)成一個(gè)植株，但有時(shí)會(huì)由于細(xì)胞分裂產(chǎn)生大量的胚性細(xì)胞，以后形成許多胚狀體，從而可以形成許多植株，這種現(xiàn)象就是所謂的叢生胚現(xiàn)象。 培養(yǎng)條件的控制（是否需要特殊處理）剝離出來的幼胚要立即接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。以幼胚搶救為目的的胚培養(yǎng)取材，必須在胚退化衰敗之前。 成熟胚(mature embryo)培養(yǎng) 幼胚(immature embryo)培養(yǎng)幼胚培養(yǎng)⒉細(xì)胞分裂素在有的植物上抑制胚生長，而有些植物可促進(jìn)胚發(fā)育。⒊胚早熟萌發(fā)。在大麥中，溫度為25 ℃％，其中綠苗占36％，白苗占64％；當(dāng)溫度提高到28 ℃時(shí)，％，其中白苗高達(dá)92％。 培養(yǎng)基對(duì)花粉白苗形成的影響主要在愈傷組織發(fā)生階段，受分化培養(yǎng)基的影響較小。 影響花粉白苗形成的因素有供體植物的基因型、花粉發(fā)育的時(shí)期、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件等。 禾谷類植物的花粉愈傷組織在器官分化時(shí)，葉綠體的發(fā)育一般是和芽組織的分化同時(shí)進(jìn)行的，由愈傷組織上芽點(diǎn)的顏色可以判斷分化出來的將是綠苗或是白苗。培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基、激素、蔗糖、其它：鐵鹽、活性炭。固體培養(yǎng)基滅菌后在凝固前加入到滅菌過的6cm培養(yǎng)皿中，每皿鋪約2mm厚，等完全凝固后，在其上層接種密度為1104的花粉懸浮液，接種量以1mm厚的液層為宜。條件培養(yǎng) 條件培養(yǎng)實(shí)質(zhì)上是一種花粉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，與普通細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法的不同之處在于，在液體培養(yǎng)基中加入了一定濃度的條件培養(yǎng)基，條件培養(yǎng)基一般是花藥提取液，取50個(gè)花藥制備10ml條件培養(yǎng)基，添加比例按9 : 1。一是機(jī)械擠壓梯度離心法 此方法是將花藥消毒后，用鑷子或小玻璃杵子將花粉從花藥中擠壓出來，然后用30％蔗糖離心收取懸浮在蔗糖溶液上層的完整花粉粒，再用培養(yǎng)基洗滌幾次后用于培養(yǎng)。使用方法：植株處理：%秋水仙素處理24～48h洗凈后種植。愈傷組織染色體的變化。13. 花藥培養(yǎng)中非單倍體出現(xiàn)的原因有哪些?花藥愈傷組織的多倍化－核內(nèi)有絲分裂。 。大量試驗(yàn)結(jié)果表明，花藥培養(yǎng)前給予一定的低溫處理、離心、高糖處理等是十分必要的。 ：外植體選擇－外植體(花蕾)預(yù)處理—外植體消毒—?jiǎng)內(nèi)』ㄋ帯臃N—誘導(dǎo)培養(yǎng)—分化培養(yǎng)通過花藥培養(yǎng)成功獲得單倍體植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。 花粉培養(yǎng)將處于一定發(fā)育階段的花粉從花藥中分離出來，再加以離體培養(yǎng)。與細(xì)胞融合相結(jié)合，使這一育種途徑更具有實(shí)際應(yīng)用意義。