【正文】 細胞工程學(xué)習(xí)指導(dǎo) 高麗萍細胞工程學(xué)習(xí)指導(dǎo)緒 論1. 細胞工程學(xué)的概念 它是應(yīng)用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，按照人們的設(shè)計藍圖，在細胞水平上的遺傳操作及進行大規(guī)模的細胞和組織培養(yǎng)。通過細胞工程可以生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品或培養(yǎng)有價值的植株，并可以產(chǎn)生新的物種或品系。（廣義）又叫離體培養(yǎng)，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。　　?。íM義）組培指用植物各部分組織，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過再分化形成再生植物。3..植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展及意義： 1902年德國植物生理學(xué)家Haberlandt提出了“細胞的全能性”原理。1962年Marshing和Shong發(fā)明了MS培養(yǎng)基.　　　　　　　　加速無性繁殖。獲取脫毒苗。擴大變異范圍：克服遠緣雜交后代不育性和雜交不親和性。通過原生質(zhì)體融合獲得體細胞雜種和胞質(zhì)雜種。倍性育種：通過胚乳培養(yǎng)獲得三倍體；通過花粉和花藥培養(yǎng)進行單倍體育種。加速親本材料的純化。一般選育自交系需4－6代花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株，染色體加倍后即為純合二倍體。種質(zhì)資源的試管保存。為基因工程的全面實施人工控制遺傳方向打下基礎(chǔ)。第一篇 植物細胞工程第一章 實驗基本技術(shù)原理1. 基 本 實 驗 室設(shè)計準備室 進行藥品的保存、配置、消毒、分裝等。器具的洗滌、干燥、消毒?！∩砩笜说臏y定等。要求寬敞明亮，通風(fēng)條件好。接種室 進行材料的接種。外設(shè)緩沖間—。要求封閉性好，干燥清潔，能較長時間保持無菌。 培養(yǎng)室 植物材料的無菌培養(yǎng)。外設(shè)緩沖間—。首要要求是要能控制光照和溫度，其次為防止微生物感染，培養(yǎng)室應(yīng)保持干燥和清潔。細胞學(xué)實驗室 。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。 生化分析室 在以培養(yǎng)細胞產(chǎn)物為主要目的的實驗室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化基本設(shè)備配置驗實驗室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時進行取樣檢查。 ，各有何利弊；；：易引起火災(zāi)； 滅菌：適于不耐高溫材料。培養(yǎng)基：濕熱滅菌，即高壓高溫蒸汽滅菌. 玻璃器皿：濕熱滅菌或干熱滅菌. 金屬器皿：干熱滅菌. 接種室：接種室常采用定期熏蒸，熏蒸劑常用甲醛加高錳酸鉀，一般每100ml甲醛加5g高錳酸鉀 MS無機鹽濃度高，微量元素種類齊全，養(yǎng)分均衡。應(yīng)用最廣，特別是培養(yǎng)再生植物。B5含較高硝酸鹽、較低的銨鹽，較高的VB1，用于細胞懸浮和原生質(zhì)、葡萄、豆科植物的培養(yǎng)。N6較高硝酸鹽、較低的銨鹽，禾本科花藥培養(yǎng)和柑橘類植物的花藥培養(yǎng)。.Nitch無機鹽濃度高，White低鹽培養(yǎng)基，用于生根培養(yǎng)。水水既是培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的溶劑，又是培養(yǎng)基的重要組成部分，它占培養(yǎng)基成分的95％。 原生質(zhì)體培養(yǎng)、則可使用一般蒸餾水或純凈水以降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效益。無 機 鹽類大量元素培養(yǎng)基的使用量一般在每升幾十至幾千毫克。包括C、H、O、N、P, K、Ca、Mg、 S 微量元素 微量元素的用量一般低于105～107克分子濃度。有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co糖是碳源和能源，多利用蔗糖， 維生素B1是必需的，B煙酸等，原生質(zhì)培養(yǎng)含有大多數(shù)基本維生素。 氨基酸細胞原生質(zhì)培養(yǎng)特別需要，水解酪蛋白， 激素細胞分裂素BA（6－芐基酰嘌呤）、KT（激動素，糠基酰嘌呤）、ZT（玉米素）、2iP（異戊烯酰嘌呤，IAA，NAA，赤霉素：GA3，乙烯及乙烯抑制瓊脂 、卡拉膠固體培養(yǎng)活性炭 防止外植體變褐附加復(fù)合成分椰子汁、酵母提取液5. 培養(yǎng)基的固化劑有哪些，作用是什么?　　瓊脂、Gelrite、塑料泡膜、玻璃絲、巖棉、玻璃珠、Gala膠。　　作用：束縛水分、吸收化合物6．.常有哪些物質(zhì)需過濾消毒IAA、ZT、GA3及某些維生素、抗生素、酶、植物提取物、秋水仙素等。7. 培養(yǎng)方式%瓊脂、卡拉膠等，液體培養(yǎng)無凝固劑，分靜止、震蕩懸浮培養(yǎng)兩種懸浮培養(yǎng)成批、半成批、連續(xù)培養(yǎng)單細胞培養(yǎng)微室、平板、看護培養(yǎng)外植體（explant）是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織、器官等材料外植體的來源用于外植體分離的母體植物材料一般有三種來源： 一是生長在自然環(huán)境下的植物； 二是有目的培育、在溫室控制環(huán)境條件下生長的植物； 三是無菌環(huán)境下已經(jīng)離體培養(yǎng)的植物。 在不影響培養(yǎng)目的的前提下盡可能選擇自然繁殖器官作外植體；一、二年生草本植物的離體培養(yǎng)比多年生植物容易；生長季節(jié)和營養(yǎng)生長階段生長啟動快、分化快。木本植物的預(yù)處理可將成年樹的芽嫁接在實生苗上，或修剪促其新枝條產(chǎn)生，或?qū)τH本植株進行高水平施肥，或用細胞分裂素噴灑植株，或進行扦插繁殖等多種措施，使親本植株部分地返回年輕狀態(tài)之后，再從親本植株上采取外植體，這些措施有可能提高成年樹外植體的活力對培養(yǎng)基的防褐有三種方法：一是在培養(yǎng)基中加抗壞血酸、檸檬酸或半胱氨酸；或用抗氧化劑浸泡外植體后再接種；或是在培養(yǎng)基中加入1％的活性炭吸附褐色醌類物質(zhì)；或加入多胺類物質(zhì)，如精胺、亞精胺通過刺激細胞分裂，加速組織生長，減少褐化二是減少光照強度或在黑暗條件下培養(yǎng)三是將外植體不斷地轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基，最好的辦法是外植體在瓶內(nèi)轉(zhuǎn)移到無褐色物質(zhì)的部位。這三種方法以第三種瓶內(nèi)轉(zhuǎn)移法最簡便、經(jīng)濟(節(jié)省培養(yǎng)基)和有效。－修理。：消毒液浸泡。11. 植物材料內(nèi)部帶菌處理方法。12. 外植體滅菌方法一次消毒程序先將采集的植物材料用紗布或尼龍網(wǎng)扎緊瓶口置于流水條件下沖洗數(shù)小時。接著用70％～75％的酒精漂洗植物材料數(shù)秒至半分鐘，以破壞有些植物材料蠟質(zhì)化表面的張力。再用消毒劑消毒。二次消毒程序即在外植體培養(yǎng)3d左右再行一次消毒。灼燒法消毒有的植物材料如胡蘿卜儲存根可采用，即將塊根于95％酒精中浸一下，置于酒精燈上灼燒，然后去除表面層，切取無菌韌皮部接種培養(yǎng)。降壓法即將植物材料與消毒液一起置于真空抽氣瓶中抽氣，以使消毒液滲入植物材料的表面，達到消毒的目的。浸沒法如五針松枝條，可浸沒在較低濃度的次氯酸鈉(鈣)消毒劑中浸泡一段時間，然后按常規(guī)消毒程序再進行一次消毒，效果也甚佳。木本植物消毒在樹木冬季休眠期采取休眠枝條，經(jīng)滅菌后放于24冰箱冷藏4050天，以破除休眠；然后取出枝條再經(jīng)滅菌，放入4050 溫水中（無菌水），在溫室中進行溫浴24小時；再浸泡在含有細胞分裂素和赤霉素的水溶液中，在30 溫室中及連續(xù)光照下催芽，當枝條長到68厘米是即可采取常規(guī)消毒方法取莖芽切段進行離體培養(yǎng)， 植物因素：基因型，植物年齡，組織和器官的年齡，植物的生理狀態(tài)，取材年份及生長條件，取材部位及大小。培養(yǎng)基因素：無機鹽；有機化合物；植物激素；天然提取物；瓊脂；PH值；滲透壓；活性炭。.環(huán)境因素：光照：。溫度。⑶濕度。⑷氣體。14..控制組培中形態(tài)建成的激素模型　　生長素與細胞分裂素的比例15..植物激素的主要生理作用　　影響培養(yǎng)中器官建成光照： 組織培養(yǎng)通常在散射光線下進行。有些植物組織在暗處生長較好，而另一些植物組織在光亮處生長較好，但由愈傷組織分化成器官時，則每日必須要有一定時間的光照才能形成芽和根（光照時間影響植株再生狀態(tài)） 溫度：在大多數(shù)情況下，適溫有利于細胞分裂，即可以提高細胞分裂速率，而適當提高溫度則有利于細胞伸長，在一定范圍內(nèi)降低培養(yǎng)溫度則使細胞分裂和生長速度均減緩，而且使細胞的質(zhì)量增加。 對大多數(shù)植物組織20～28℃即可滿足生長所需，其中26～27℃最適合。滲透壓：滲透壓對植物組織的生長和分化很有關(guān)系。在培養(yǎng)基中添加食鹽、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物質(zhì)可以調(diào)整滲透壓。通常1～2個大氣壓可促進植物組織生長，2個大氣壓以上時，出現(xiàn)生長障礙，6個大氣壓時植物組織即無法生存。通氣： 懸浮培養(yǎng)中細胞的旺盛生長必須有良好的通氣條件。小量懸浮培養(yǎng)時巨常轉(zhuǎn)動或振蕩，可起通氣和攪拌作用。大量培養(yǎng)中可采用專門的通氣和攪拌裝置。PH：～。第二章 細胞全能性與形態(tài)發(fā)生〔totipotency〕概念指每個植物細胞都具有形成完整植株的能力，因為每個細胞都具有全套的遺傳基因，無論是性細胞還是體細胞在特定條件下可以進行表達。條件是有生命力的核和完整的膜系統(tǒng)。 細胞全能性的絕對性與相對性:不是所有基因型的所有細胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應(yīng)。 即使對于植物細胞而言，細胞全能性也并不意味著任何細胞均可以直接產(chǎn)生植物個體。 動、植物細胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。外植體〔explant〕：從植物體上分離下來的用于離體培養(yǎng)的材料。分化〔differentiation〕：細胞在分裂過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變，從而在個發(fā)育中形成各類組織和器官完成整個生活周期。脫分化〔dedifferentiation〕:已分化好的細胞在人工誘導(dǎo)條件下，恢復(fù)分生能力，回復(fù)到分化組織狀態(tài)的過程。再分化〔redifferentiation〕:脫分化后具有分生能力的細胞再經(jīng)過與原來相同的分化過程，重新形成各類組織和器官的過程。愈傷組織〔callus〕:在離體培養(yǎng)過程中形成的具有分生能力的一團不規(guī)則細胞，多在外植體切面上產(chǎn)生。胚狀體〔embroid〕:—對應(yīng)于胚〔embryo〕，在離體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生一種形似胚（具有明顯的根端和芽端），功能與胚相同的結(jié)構(gòu)。繼代培養(yǎng)：更換新鮮培養(yǎng)基來繁殖同種類型的材料（）。脫分化細胞的特點 細胞質(zhì)顯著變濃，大液泡消失，核體積增加并逐漸移位至細胞中央，細胞器增加。在這些變化中，液泡蛋白體的出現(xiàn)和質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體被認為是細胞脫分化的重要特征。細胞脫分化的調(diào)控機理細胞脫分化調(diào)控的實質(zhì)即是G0期細胞回復(fù)到分裂周期的調(diào)控過程 細胞周期蛋白（cyclin）和依賴周期蛋白激酶(CDK cyclindependent kinase)是兩類主要的調(diào)控分子。細胞周期運行的動力主要來自CDK，其活性則主要通過cyclin調(diào)節(jié)和依賴周期蛋白抑制子（CKI cyclindependent kinase inhibitor）的負調(diào)節(jié)。 植物激素是離體培養(yǎng)中所必需的條件，因此與植物激素相關(guān)的基因表達被認為是啟動細胞脫分化的關(guān)鍵。 細胞脫分化與愈傷組織形成細胞脫分化是細胞狀態(tài)的改變，但成功的脫分化必然會導(dǎo)致細胞分裂， 脫分化與愈傷組織的形成在性質(zhì)上是不能等同的，脫分化是細胞生理狀態(tài)的改變，而形成愈傷組織是離體培養(yǎng)中的一個階段。 盡管細胞脫分化后進入細胞分裂的結(jié)果，在大多數(shù)情況下是形成愈傷組織，但絕不是說所有的細胞脫分化的結(jié)果都必然形成愈傷組織，許多試驗表明，有些外植體的細胞脫分化以后直接形成胚性細胞進而形成體細胞胚。 愈傷組織內(nèi)的細胞并不是均一未分化的，即同一愈傷組織內(nèi)的細胞之間其狀態(tài)存在一定差異，特別是在組織器官培養(yǎng)時，往往出現(xiàn)部分細胞不完全脫分化的現(xiàn)象，從而使其很容易再分化再生植株，這對培養(yǎng)來說無疑是十分有利的。細胞分化概念及其特點指導(dǎo)致細胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。 一個細胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)和機能，這是在時間上的分化； 同一種細胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)和機能，這是在空間上的分化從分化的遺傳控制角度講，細胞分化是各個處于不同時空條件下的細胞，基因表達與修飾差異的反應(yīng)，所以，分化也可以說是相同基因型的細胞由于基因選擇性表達所反應(yīng)的各種不同的表現(xiàn)型。通常把離體培養(yǎng)中TE（TE tracheary elements）細胞的出現(xiàn)作為組織分化的標志極性（polarity）所謂極性是指植物的器官、組織、甚至單個細胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。在很多情況下，細胞的不均等分裂是細胞極性建立的標志。 影響脫分化和再分化的因素 激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細胞脫分化和再分化的主要因素，其中生長素和細胞分裂素是兩類主要的調(diào)控培養(yǎng)條件下細胞生長和分化的植物激素。在眾多植物離體培養(yǎng)中證明，細胞分裂素和生長素對于細胞生長和分化具有同等重要的協(xié)同作用，它們的量與比值的不同配合，對細胞分化起著重要調(diào)節(jié)作用。在離體條件下，如果用生長素和細胞分裂素處理的順序不同，其作用也不一樣。如果先用生長素處理，后用細胞分裂素處理，則有利于細胞分裂而不利于細胞分化；反之，則有利于細胞分化。如果兩者同時處理，則可促使分化頻率的提高?胚胎培養(yǎng)，器官培養(yǎng)，組織培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)。?固體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)，半固體培養(yǎng)，雙層培養(yǎng)。⒈通過愈傷組織分化芽，再分化根。⒉直接分化芽和根。⒊直接分化根，再分化芽。⒋外植體直接產(chǎn)生胚狀體。12. 植物的離體器官發(fā)生方式及過程離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程器官發(fā)生方式有先生芽后生根、先生根后生芽、根芽同時生長三種方式器官發(fā)生過程有經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程和不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生兩種過程。 第一種過程是從愈傷組織生長中心器官原基 第二種過程中一是外植體中已存在器官原基，進一步