【正文】 培養(yǎng)即形成相應(yīng)組織器官進(jìn)而再生植株，如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)。另一種情況是外植體某些部位的細(xì)胞在重新分裂后，直接形成分生細(xì)胞團(tuán)，然后由分生細(xì)胞團(tuán)形成器官原基。這種不經(jīng)過(guò)愈傷組織直接發(fā)生器官的途徑在以品種繁殖為目的的離體培養(yǎng)中具有重要的實(shí)踐意義。 ？誘導(dǎo)腋芽。誘導(dǎo)不定芽。從莖尖或頂端分生組織中誘導(dǎo)。14..愈傷組織類型及特征結(jié)構(gòu)致密型：表面光滑有光澤，結(jié)構(gòu)致密，多為淡黃色或白色，易于再生芽結(jié)構(gòu)松散型：多為白色，可以用于懸浮系建立。胚性愈傷組織：具有產(chǎn)生胚狀體能力。外植體：種類及基因型，外植體供體植株及外植體本身生理生化特征，包括供體植株年齡、發(fā)育階段、生長(zhǎng)環(huán)境、取材位置，外植體大小，外植體極性培養(yǎng)基成分：基本培養(yǎng)基，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，其它成分環(huán)境條件：光，溫度總體上說(shuō)，被子植物比裸子植物容易培養(yǎng)，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培養(yǎng)成功的報(bào)道最多。通常情況下，自然繁殖以無(wú)性繁殖為主的植物在培養(yǎng)條件下也有較強(qiáng)的器官分化的能力 同種植物不同品種（基因型）的培養(yǎng)效果具有較大差異已是不爭(zhēng)的事實(shí)。 基因型對(duì)于培養(yǎng)反應(yīng)的差異，器官分化能力的差異大于愈傷組織誘導(dǎo)的差異。 外植體對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)及其再生能力的影響體還現(xiàn)在生理狀態(tài)上 ，來(lái)源于生長(zhǎng)活躍或生長(zhǎng)潛力大的組織、器官的細(xì)胞更有利于培養(yǎng) 。對(duì)于多年生植物而言，以幼嫩組織為材料無(wú)論是誘導(dǎo)還是分化均較容易。 一、二年生無(wú)性繁殖植物的取材則可塑性較大，但仍以自然繁殖器官為外植體更易成功。 光照是離體培養(yǎng)中比較復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子，光照時(shí)間、強(qiáng)度以及光質(zhì)對(duì)器官分化均有影響。連續(xù)的光照有利于培養(yǎng)細(xì)胞維管組織的形成，而一定的晝夜光照周期則有利于極性建立和形態(tài)發(fā)生。 培養(yǎng)條件下，光照的作用更大程度上是調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化狀態(tài)，而不是合成光合產(chǎn)物。 光照對(duì)器官發(fā)生的調(diào)節(jié)可能與調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的內(nèi)源激素平衡有關(guān)，光照還可能影響生長(zhǎng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)整生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，從而引起器官分化。 光質(zhì)對(duì)器官分化的影響可能與光受體精確調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關(guān)離體培養(yǎng)下沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精過(guò)程，但經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程所形成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞）其一，體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)別于無(wú)融合生殖胚；其二，體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，單細(xì)胞起源，以區(qū)別于合子胚； 其三，體細(xì)胞發(fā)育程序同合子胚相似，經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程，也經(jīng)過(guò)球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚，以區(qū)別與離體培養(yǎng)中器官發(fā)生形成個(gè)體的途徑其四，和周圍細(xì)胞之間有隔離。其五，和培養(yǎng)物質(zhì)沒(méi)有維管束聯(lián)系，所以容易從培養(yǎng)物質(zhì)上剝離。其六，可以在不附加任何激素的培養(yǎng)基上萌發(fā)。直接胚狀體發(fā)生細(xì)胞胚從外植體上直接產(chǎn)生。間接胚狀體發(fā)生經(jīng)過(guò)愈傷組織的體細(xì)胞胚形成，或經(jīng)過(guò)懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚形成。由花粉產(chǎn)生的單倍體胚狀體。由原生質(zhì)體產(chǎn)生胚狀體與器官發(fā)生形成個(gè)體的途徑相比，體細(xì)胞胚發(fā)育再生植株有兩個(gè)明顯的特點(diǎn)： 一是體細(xì)胞胚具有雙極性（doulble polarity）；有分化明顯的生物兩端，根端和芽端。二是體細(xì)胞胚形成后與母體的維管束系統(tǒng)連系較少，即出現(xiàn)所謂的生理隔離（physiological isolation）現(xiàn)象。與合子胚比較： 合子胚在發(fā)育初期具有明顯的胚柄，而體細(xì)胞胚一般沒(méi)有真正的胚柄只有類似胚柄的結(jié)構(gòu)； 合子胚的子葉是相當(dāng)規(guī)范的，可以作為分類的依據(jù)，體細(xì)胞胚的子葉常不規(guī)范；與相同植物比較體細(xì)胞胚的體積明顯小于合子胚；在一些貯藏物質(zhì)的含量上也存在較大差異；并且，體細(xì)胞胚不能有明顯的脫水干燥過(guò)程。 合子胚在胚胎發(fā)育完全進(jìn)入子葉期胚以后，經(jīng)過(guò)一系列的物質(zhì)積累和脫水就進(jìn)入休眠，而體細(xì)胞胚則直接形成植株；在不同的培養(yǎng)條件和植株種類中，形成植株的胚胎時(shí)期有所不同，一般在心形期以后的各個(gè)階段均可直接發(fā)育成小植株。胚狀體原始細(xì)胞特征：原生質(zhì)濃厚，細(xì)胞核較大，處于細(xì)胞質(zhì)中央。胚狀體異?，F(xiàn)象單片子葉；多子葉；杯狀胚狀體；柱狀胚狀體。激素的調(diào)控作用2,4D是應(yīng)用最為廣泛的生長(zhǎng)素。2,4D的應(yīng)用有規(guī)律性的變化，首先是在較高濃度下誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成，然后在降低2,4D的濃度下產(chǎn)生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生長(zhǎng)素有利于體細(xì)胞胚的繼續(xù)發(fā)育。 細(xì)胞分裂素對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)育的影響研究報(bào)道較少，但幾乎所有的有關(guān)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的培養(yǎng)基配方中，均有細(xì)胞分裂素的配合使用。細(xì)胞分裂素在促進(jìn)細(xì)胞分裂，維持細(xì)胞活躍生長(zhǎng)中具有重要生理功能，而完成體細(xì)胞胚胎發(fā)育細(xì)胞分裂是基本前體，當(dāng)胚胎結(jié)構(gòu)建立后，細(xì)胞分裂素對(duì)于維持分生組織正常發(fā)育具有重要作用。 培養(yǎng)基中的氮源亦會(huì)顯著影響離體條件下的胚胎發(fā)生，一些氨基酸可以代替還原態(tài)氮的作用，一些體細(xì)胞胚規(guī)模生產(chǎn)模式的試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，球形胚形成后，如果降低培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃度，可以顯著促進(jìn)體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育。 一些試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚發(fā)育后期降低蔗糖濃度，也有利于胚的繼續(xù)發(fā)育和提高體細(xì)胞胚的成苗率第三章 原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞雜交 原生質(zhì)體的概念 原生質(zhì)體：指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說(shuō)一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。亞原生質(zhì)體：在原生質(zhì)體分離過(guò)程中，有時(shí)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)含物的斷裂而形成一些較小的原生質(zhì)體就叫做亞原生質(zhì)體。它可以具有細(xì)胞核或沒(méi)有細(xì)胞核。核質(zhì)體：由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原生質(zhì)體(miniprotoplast)。胞質(zhì)體：不含細(xì)胞核而僅含有部分細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體研究進(jìn)展 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)研究中幾個(gè)值得提出重要成就：1880年，Hanstein首次起用原生質(zhì)體(protoplast)一詞。1960年，Cocking首次應(yīng)用酶法制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功。 1971年，Takebe et 。1986年，Spangenberg et 。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已有49個(gè)科，146個(gè)屬的320多種植物經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到了再生植株（1993）。其趨勢(shì)仍以農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物為主，但從一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物擴(kuò)展。原生質(zhì)體研究的意義植物原生質(zhì)體之所以能成為植物細(xì)胞工程的理想研究材料，是因?yàn)樗哂幸韵轮匾攸c(diǎn)：①易于從同一種植物材料的組織中獲得大量的遺傳上同一的游離原生質(zhì)體，為植物細(xì)胞的遺傳操作的微生物化奠定了基礎(chǔ)；②可以像動(dòng)物細(xì)胞一樣，被誘導(dǎo)與其他物種的原生質(zhì)體融合，從而有效地克服了不同物種細(xì)胞之間的有性不親和障礙，為實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣物種間的體細(xì)胞雜交，培育新種提供了新的手段；③它既可以捕獲外源DNA，也可以捕獲較大的細(xì)胞器，如病毒顆粒、葉綠體、線粒體等，因此是植物遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體；④保持著植物細(xì)胞的全能性，在適宜的培養(yǎng)條件下，可以重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁，進(jìn)行細(xì)胞分裂、分化，形成完整的小植株；⑤植物原生質(zhì)體雖然沒(méi)有細(xì)胞壁，但仍然進(jìn)行著植物細(xì)胞的各種生命活動(dòng)，包括蛋白質(zhì)和核酸的合成，光合作用，呼吸作用，通過(guò)膜向外界進(jìn)行物質(zhì)交換等。制備原生質(zhì)體的外植體、預(yù)處理及分離措施用于分離原生質(zhì)體的常用材料是無(wú)菌試管苗葉片,上胚軸和子葉,培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)處理?xiàng)l件：在游離原生質(zhì)體前對(duì)供體材料進(jìn)行預(yù)處理及預(yù)培養(yǎng)，可以提高某些材料原生質(zhì)體的活力和分裂頻率。用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處理方法不同。 葉片脫壁方法：酶包括纖維素酶、果膠酶處理，其濃度比例隨年齡和生理而變化。 原生質(zhì)體的收集和純化方法飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percoll、Ficoll。沉淀法：常用甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，先將酶液洗出干凈，再用Percoll飄浮一次。 原生質(zhì)體活力測(cè)定目測(cè)法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、流動(dòng)性確定原生質(zhì)體活力。FDA法：FDA（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，能自由地穿越細(xì)胞質(zhì)膜，在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過(guò)質(zhì)膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過(guò)具熒光的細(xì)胞的觀察確定細(xì)胞活性。伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過(guò)質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞使，細(xì)胞才能被染色，因而可以通過(guò)細(xì)胞被染色與否確定活性。 影響原生質(zhì)體活力的因素 分離材料的生理狀態(tài)酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶溶液的滲透壓分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時(shí)間環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響 原生質(zhì)體培養(yǎng)基 大量元素濃度中注意 NO3－和NH4+的比例；Ca2+濃度；有機(jī)成分中含有維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 培養(yǎng)基注意調(diào)節(jié)常用滲透壓：常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生質(zhì)體的滲透壓原則：培養(yǎng)基滲透壓與細(xì)胞滲透壓等滲。 原生質(zhì)體培養(yǎng)方法及其優(yōu)缺點(diǎn)液體淺層培養(yǎng) 將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，對(duì)原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。 缺點(diǎn)：是原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步的生長(zhǎng)和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育情況。 固體平板培養(yǎng) 固體培養(yǎng)也就是瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點(diǎn)的瓊脂糖可在30176。C左右融化與原生質(zhì)體混合而不影響原生質(zhì)體的 生命活動(dòng)?；旌虾蟮暮性|(zhì)體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：可以跟蹤觀察單個(gè)原生質(zhì)體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體分裂頻率。 缺點(diǎn)：是操作要求嚴(yán)格，尤其是混合時(shí)的溫度掌握必需合適，溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原生質(zhì)體不易混合均勻。液體－固體雙層培養(yǎng)即在培養(yǎng)皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。 優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。 缺點(diǎn)：不易觀察細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程。 瓊脂糖珠培養(yǎng) 將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50ml一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進(jìn)一步的生長(zhǎng)和發(fā)育。這種方法由于改善了培養(yǎng)物的通氣和營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，從而促進(jìn)了原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。 原生質(zhì)體發(fā)育與植株再生 細(xì)胞壁的再生 原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后開(kāi)始再生新的細(xì)胞壁，一至數(shù)天內(nèi)便可形成完整的細(xì)胞壁。 只有能形成完好細(xì)胞壁的再生細(xì)胞才能進(jìn)入細(xì)胞分裂的階段。 細(xì)胞分裂和生長(zhǎng) 原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)天后，胞質(zhì)增加，細(xì)胞器增殖，RNA、蛋白質(zhì)及多聚糖合成增加，不久即可發(fā)生核的有絲分裂及胞質(zhì)分裂。一般原生質(zhì)體培養(yǎng)2～7 d后開(kāi)始第一次分裂，但開(kāi)始第一次分裂的時(shí)間隨植物的種類、分離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異。愈傷組織形成大多數(shù)情況下原生質(zhì)體培養(yǎng)二周后，形成多細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，三周后形成肉眼可見(jiàn)的小細(xì)胞克隆，大約六周后形成直徑1 mm的小愈傷組織。原生質(zhì)體培養(yǎng)7～10天后必需及時(shí)添加新鮮培養(yǎng)基，否則形成的細(xì)胞團(tuán)不繼續(xù)生長(zhǎng)。待小愈傷組織長(zhǎng)至1mm左右時(shí)應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上使其進(jìn)一步生長(zhǎng)。植株再生將原生質(zhì)體形成的愈傷組織直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上可一步成苗。然而，越來(lái)越多的試驗(yàn)證明，兩步成苗法更適合大多數(shù)植物原生質(zhì)體再生植株。即：首先將愈傷組織培養(yǎng)于含低濃度生長(zhǎng)素培養(yǎng)基上，讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)，再將其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化成苗。1影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素 基因型 較早的試驗(yàn)曾證明矮牽牛葉肉原生質(zhì)體的不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期是受不同基因所控制的。原生質(zhì)體的來(lái)源 供體材料體類型 向日葵幼葉、子葉和下胚軸原生質(zhì)體的培養(yǎng)，結(jié)果只有下胚軸原生質(zhì)體培養(yǎng)后得到了細(xì)胞團(tuán)和體細(xì)胞胚，而幼葉和子葉原生質(zhì)體均未獲得成功。 供體細(xì)胞的分化程度 同一個(gè)基因型的植株生長(zhǎng)在不同的環(huán)境條件下，它們的生理狀態(tài)會(huì)有改變。供試植株最好生長(zhǎng)在控制條件下，以便提高原生質(zhì)體的細(xì)胞分裂頻率和再生能力，并且可以提高試驗(yàn)的重復(fù)性。起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基激素水平 基本起始密度 適宜密度為1105/ml左右 1植物細(xì)胞雜交的幾個(gè)重要進(jìn)展1960年，Kocking用酶法制備高等植物原生質(zhì)體首次獲得成功；1971年，Takebe首次從離體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)中獲得再生完整植株；1972年，Carlson首次獲得粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的細(xì)胞雜種，這是第一個(gè)植物細(xì)胞雜種；1974年，Kao將聚乙二醇誘導(dǎo)融合法應(yīng)用于植物細(xì)胞融合并建立了相應(yīng)的融合技術(shù)；1978年，Melchers獲得了第一個(gè)屬間細(xì)胞雜種（番茄＋馬鈴薯）；1981年，Zimmerman發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電融合概念；1987年，Schweiger建立了單對(duì)原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序。 1細(xì)胞融合的意義理論上說(shuō)任何細(xì)胞，都有可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對(duì)于種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。 融合過(guò)程不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。 體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來(lái)自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過(guò)程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。 1原生質(zhì)體融合類型根據(jù)融合時(shí)細(xì)胞的完整程度，原生質(zhì)體融合可分為兩大類：對(duì)稱融合（asymmetric fusion）－即兩個(gè)完整的細(xì)胞原生質(zhì)體融合。非對(duì)稱融合（symmetric fusion）－利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合， 1細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法用于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩大類：物理方法常采用射線處理，如X射線、射線等，它們能使細(xì)胞核失活；化學(xué)處理目前常用的試劑有，核失活－碘乙