【正文】 細胞全能性與形態(tài)發(fā)生〔totipotency〕概念指每個植物細胞都具有形成完整植株的能力，因為每個細胞都具有全套的遺傳基因，無論是性細胞還是體細胞在特定條件下可以進行表達。木本植物消毒在樹木冬季休眠期采取休眠枝條，經(jīng)滅菌后放于24冰箱冷藏4050天，以破除休眠；然后取出枝條再經(jīng)滅菌，放入4050 溫水中（無菌水），在溫室中進行溫浴24小時；再浸泡在含有細胞分裂素和赤霉素的水溶液中，在30 溫室中及連續(xù)光照下催芽，當枝條長到68厘米是即可采取常規(guī)消毒方法取莖芽切段進行離體培養(yǎng)， 植物因素：基因型，植物年齡，組織和器官的年齡，植物的生理狀態(tài)，取材年份及生長條件，取材部位及大小。 氨基酸細胞原生質(zhì)培養(yǎng)特別需要，水解酪蛋白， 激素細胞分裂素BA（6－芐基酰嘌呤）、KT（激動素，糠基酰嘌呤）、ZT（玉米素）、2iP（異戊烯酰嘌呤，IAA，NAA，赤霉素：GA3，乙烯及乙烯抑制瓊脂 、卡拉膠固體培養(yǎng)活性炭 防止外植體變褐附加復(fù)合成分椰子汁、酵母提取液5. 培養(yǎng)基的固化劑有哪些，作用是什么?　　瓊脂、Gelrite、塑料泡膜、玻璃絲、巖棉、玻璃珠、Gala膠。外設(shè)緩沖間—。獲取脫毒苗。通過細胞工程可以生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品或培養(yǎng)有價值的植株，并可以產(chǎn)生新的物種或品系。倍性育種：通過胚乳培養(yǎng)獲得三倍體；通過花粉和花藥培養(yǎng)進行單倍體育種。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。 在不影響培養(yǎng)目的的前提下盡可能選擇自然繁殖器官作外植體；一、二年生草本植物的離體培養(yǎng)比多年生植物容易；生長季節(jié)和營養(yǎng)生長階段生長啟動快、分化快。溫度。 即使對于植物細胞而言，細胞全能性也并不意味著任何細胞均可以直接產(chǎn)生植物個體。 愈傷組織內(nèi)的細胞并不是均一未分化的，即同一愈傷組織內(nèi)的細胞之間其狀態(tài)存在一定差異，特別是在組織器官培養(yǎng)時，往往出現(xiàn)部分細胞不完全脫分化的現(xiàn)象，從而使其很容易再分化再生植株，這對培養(yǎng)來說無疑是十分有利的。 第一種過程是從愈傷組織生長中心器官原基 第二種過程中一是外植體中已存在器官原基，進一步培養(yǎng)即形成相應(yīng)組織器官進而再生植株，如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)。 培養(yǎng)條件下，光照的作用更大程度上是調(diào)節(jié)細胞的分化狀態(tài)，而不是合成光合產(chǎn)物。 細胞分裂素對體細胞胚發(fā)育的影響研究報道較少，但幾乎所有的有關(guān)體細胞胚胎發(fā)生的培養(yǎng)基配方中，均有細胞分裂素的配合使用。1986年，Spangenberg et 。 培養(yǎng)基注意調(diào)節(jié)常用滲透壓：常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。培養(yǎng)過程中，通過調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進一步的生長和發(fā)育。 供體細胞的分化程度 同一個基因型的植株生長在不同的環(huán)境條件下，它們的生理狀態(tài)會有改變。 電融合法分離過程必須快速并在低溫下進行，在分離和保存緩沖液中加入適量的鎂離子和甘油有利于核膜的完整性。有時花粉培養(yǎng)也稱為小孢子培養(yǎng)(microspore culture)。—均等分裂為兩個子細胞，以后不斷發(fā)育。 二是自然散粉法 這一方法可以和預(yù)培養(yǎng)結(jié)合進行，一般是將消毒后的花藥接種在液體培養(yǎng)基中，在一定的溫度條件下進行振蕩培養(yǎng)，讓花粉從花藥中自行散落到培養(yǎng)基中，再除去花藥壁等，將花粉重新培養(yǎng)在新鮮培養(yǎng)基上。 花粉白苗除外觀上缺乏綠色外，并無其它形態(tài)上的變異。 幼胚剝離胚剝離的成功與否是幼胚培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵。游離核階段時間長短因植物不同而異。供體植株原有的倍性水平在培養(yǎng)細胞多倍化過程中起著重要作用，處于二倍體水平上的細胞比處于單倍體水平上的細胞較為穩(wěn)定。如果這種DNA重復(fù)復(fù)制多次發(fā)生，細胞內(nèi)DNA含量就會不斷上升。 體細胞無性系變異的誘導(dǎo)與選擇的優(yōu)點體細胞無性系變異的篩選有以下一些明顯的優(yōu)點： 可以在小空間內(nèi)對大量個體進行選擇。 轉(zhuǎn)座子插入誘變轉(zhuǎn)座子插入誘變是近年來利用分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展起來的新的體細胞變異誘導(dǎo)方法。跟常規(guī)的繁殖方法相比它是一種微型操作過程，因此，有時就直接稱之為微繁(micropropagation)。實際生產(chǎn)上只允許增殖培養(yǎng)基上于一定培養(yǎng)時間內(nèi)(繼代天數(shù)48周)形成4—5個芽作為其確切的繁殖系數(shù)。 芽的分生組織區(qū)也應(yīng)存在與根尖分生組織同樣的情況。早期的人工種子概念是：體細胞胚經(jīng)過人工種皮包被后而形成的體細胞種子。 同時，它最好能夠提供類似于胚乳的營養(yǎng)物質(zhì)，以供繁殖體發(fā)芽的需要。但是，這種理想狀態(tài)不容易得到。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。 這種方法的優(yōu)點是操作簡單，不影響細胞活力。1．液體淺層培養(yǎng)：　　先將細胞制成一定密度的細胞懸浮液，用吸管將懸浮液移到培養(yǎng)皿中形成淺層，一般1mm左右，石蠟?zāi)し饪?，靜置培養(yǎng)。獲得了細胞團以后繼續(xù)培養(yǎng)形成愈傷組織微室培養(yǎng)是細胞學(xué)研究的優(yōu)良實驗體系。用平板培養(yǎng)的需要統(tǒng)計植板率，即每個平板接種細胞總數(shù)中形成細胞團的百分數(shù)。因此，通過饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化細胞。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度；必要的附加物質(zhì)。 液體狀態(tài)下便于細胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細胞狀態(tài)可以相對保持一致，因此有利于在細胞水平上進行各種遺傳操作，生理生化活動的研究，同時為植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。 微型變態(tài)器官繁殖體不能過度脫水，但亦需要適當干燥，除去表面及多余的水分，同時要進行表面消毒處理以繁殖包被后的感染。）。與外植體類型有關(guān)，如頂芽最低，基部莖段次之，中部莖段最高。一切通過其它增殖方式不能成功的植物，均可以通過此途徑獲得組培苗。體細胞突變技術(shù)的不斷成熟，使多細胞生物大群體突變的建立成為可能。 以細胞或原生質(zhì)體，則可以選擇X射線、紫外線等。DNA序列的選擇性擴增與丟失DNA序列的擴增與丟失也是體細胞無性系變異的原因之一。在因培養(yǎng)類型引起的變異中，不僅有染色體倍性的異常變異，同時基因突變、染色體結(jié)構(gòu)變異、以及非DNA水平引起的變異亦相繼增加。一些單基因控制的性狀不僅發(fā)生隱形突變，也發(fā)生顯性突變。裸子植物的胚乳為配子體的一部分，由大孢子直接分裂發(fā)育而成，因此它屬于單倍體組織。Hanning早在1904年就培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，發(fā)現(xiàn)離體胚可以充分發(fā)育，并且提前萌發(fā)形成小苗，這是世界上胚培養(yǎng)最早獲得成功的一例。 染色體結(jié)構(gòu)的變異可能是白化苗的成因。預(yù)處理：花蕾低溫處理2－7天為宜，也可高溫、輻射、黑暗處理?！　　　　』ㄐ蛱幚恚?秋水仙素溶液中24～48h。根據(jù)Sunderland,、Wicks和Norreel的研究，可以把早期的花粉發(fā)育分為三類： 作為遺傳工程受體更為有效。染色體原位雜交生化鑒定：同功酶鑒定。 1 原生質(zhì)體的融合 方法 PEG誘導(dǎo)融合的特點：其優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。1影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素 基因型 較早的試驗曾證明矮牽牛葉肉原生質(zhì)體的不同生長發(fā)育時期是受不同基因所控制的。液體－固體雙層培養(yǎng)即在培養(yǎng)皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。原生質(zhì)體研究進展 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)研究中幾個值得提出重要成就：胚狀體原始細胞特征：原生質(zhì)濃厚，細胞核較大，處于細胞質(zhì)中央。對于多年生植物而言，以幼嫩組織為材料無論是誘導(dǎo)還是分化均較容易。⒉直接分化芽和根。細胞周期運行的動力主要來自CDK，其活性則主要通過cyclin調(diào)節(jié)和依賴周期蛋白抑制子（CKI cyclindependent kinase inhibitor）的負調(diào)節(jié)。PH：～。浸沒法如五針松枝條，可浸沒在較低濃度的次氯酸鈉(鈣)消毒劑中浸泡一段時間，然后按常規(guī)消毒程序再進行一次消毒，效果也甚佳。有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co糖是碳源和能源，多利用蔗糖， 維生素B1是必需的，B煙酸等，原生質(zhì)培養(yǎng)含有大多數(shù)基本維生素。 培養(yǎng)室 植物材料的無菌培養(yǎng)?！　　　　　　　〖铀贌o性繁殖。加速親本材料的純化。 生化分析室 在以培養(yǎng)細胞產(chǎn)物為主要目的的實驗室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化基本設(shè)備配置驗實驗室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時進行取樣檢查。木本植物的預(yù)處理可將成年樹的芽嫁接在實生苗上，或修剪促其新枝條產(chǎn)生，或?qū)τH本植株進行高水平施肥，或用細胞分裂素噴灑植株，或進行扦插繁殖等多種措施，使親本植株部分地返回年輕狀態(tài)之后，再從親本植株上采取外植體，這些措施有可能提高成年樹外植體的活力對培養(yǎng)基的防褐有三種方法：一是在培養(yǎng)基中加抗壞血酸、檸檬酸或半胱氨酸；或用抗氧化劑浸泡外植體后再接種；或是在培養(yǎng)基中加入1％的活性炭吸附褐色醌類物質(zhì)；或加入多胺類物質(zhì)，如精胺、亞精胺通過刺激細胞分裂，加速組織生長，減少褐化二是減少光照強度或在黑暗條件下培養(yǎng)三是將外植體不斷地轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基，最好的辦法是外植體在瓶內(nèi)轉(zhuǎn)移到無褐色物質(zhì)的部位。⑶濕度。 動、植物細胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。細胞分化概念及其特點指導(dǎo)致細胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。另一種情況是外植體某些部位的細胞在重新分裂后，直接形成分生細胞團，然后由分生細胞團形成器官原基。 光照對器官發(fā)生的調(diào)節(jié)可能與調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的內(nèi)源激素平衡有關(guān)，光照還可能影響生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)整生長素的極性運輸，從而引起器官分化。細胞分裂素在促進細胞分裂，維持細胞活躍生長中具有重要生理功能，而完成體細胞胚胎發(fā)育細胞分裂是基本前體，當胚胎結(jié)構(gòu)建立后，細胞分裂素對于維持分生組織正常發(fā)育具有重要作用。據(jù)統(tǒng)計，目前已有49個科，146個屬的320多種植物經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到了再生植株（1993）。原生質(zhì)體的滲透壓原則：培養(yǎng)基滲透壓與細胞滲透壓等滲。這種方法由于改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進了原生質(zhì)體的分裂和細胞團的形成。供試植株最好生長在控制條件下，以便提高原生質(zhì)體的細胞分裂頻率和再生能力，并且可以提高試驗的重復(fù)性。與PEG融合比較起來有三大優(yōu)點： 不存在對細胞的毒害問題； 融合效率高； 融合技術(shù)操作簡便。 從原生質(zhì)體中分離細胞核時，首先要制備大量的原生質(zhì)體，然后將原生質(zhì)體在低滲分離緩沖液中經(jīng)適當溫和的機械力處理可使其裂解，再采用分步過濾和離心的方法可得到較純凈的細胞核。從培養(yǎng)方法和技術(shù)方面來講，它屬于細胞培養(yǎng)的范疇。 ：花藥看護培養(yǎng) 這一方法是Sharp在1972年在番茄花粉培養(yǎng)中創(chuàng)建的，具體做法是：取適宜發(fā)育時期的蕾消毒，取出花藥。缺綠的程度由完全白色到淺黃色不等，此外，有時還存在一種葉面呈綠白鑲嵌的條紋狀植株，但此種植株數(shù)量甚少。 理論研究領(lǐng)域的應(yīng)用？⒈按照正常的胚胎發(fā)育途徑形成植株：從球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚直至長成再生植株。幼胚是一種半透明、高粘稠狀組織，剝離過程中極易失水干縮，一定要注意保濕，且操作要迅速。 細胞型胚乳 和核型胚乳不同，細胞型胚乳的發(fā)育不經(jīng)過游離核階段而按正常的細胞分裂方式進行。 植物種內(nèi)基因型間變異頻率差異較大。 染色體斷裂與重組染色體結(jié)構(gòu)變異是體細胞變異的另一重要類型。篩選可以在幾個細胞周期內(nèi)完成，且不受季節(jié)限制。轉(zhuǎn)座子既可直接將外源基因帶入細胞內(nèi)獲得新性狀，又可以獨立插入通過其轉(zhuǎn)座功能誘導(dǎo)變異。 離體微繁殖技術(shù)的應(yīng)用，首先應(yīng)歸功于Morel，他在1960年首先建立了蘭花離體繁殖的方法。根據(jù)繁殖系數(shù)可推算這種植物無性快繁在一年內(nèi)獲得的試管苗總數(shù)，即年增長率；第一次增殖芽數(shù)X繁殖系數(shù)”(”為一年內(nèi)繼代次數(shù))。 生長競爭學(xué)說的基本內(nèi)容：植物細胞同病毒之間有相互競爭的關(guān)系，在莖尖分生組織區(qū)植物細胞合成代謝旺盛，細胞分裂活躍，細胞的正常核蛋白的合成占優(yōu)勢，病毒競爭不到營養(yǎng)無法自身繁殖，而在細胞伸長期間病毒蛋白合成就可以占優(yōu)勢，造成病毒蔓延。 現(xiàn)在指任何一種經(jīng)人工種皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖體均可稱之為人工種子。 此外由于繁殖體的含水量較高，貯存中極易受到微生物感染危害，因此介質(zhì)中還應(yīng)含有適當?shù)臍⒕鷦?。到目前為止，還不能完全做到只有游離的單細胞，通常里面還有小細胞團，這是由于植物細胞具有聚集在一起的特性。細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2～3天甚至更短時間便可增加一倍。精細度較差?！　?yōu)點：培養(yǎng)物與空氣接觸面大，通氣性好；細胞代謝產(chǎn)物容易擴散，不會造成有害物質(zhì)的危害,繼代培養(yǎng)方便、便于觀察。 從工程的角度講必須要進一步研究和開發(fā)適宜于植物細胞生長和生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)； 從培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下三個條件：培養(yǎng)的細胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物；細胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物；代謝產(chǎn)物要在細胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。這一方法同樣也可用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，用于觀察細胞壁的再生與細胞分裂過程。2．植板率的測定：　 因為草酸鹽能結(jié)合細胞間質(zhì)中果膠鈣的鈣離子。 饑餓導(dǎo)致的細胞分裂受阻常常是使細胞不能合成DNA，即不能進入S期，或細胞分裂不能進行，即不能進入M期。選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。懸浮培養(yǎng)概念、特點、目的、制備 懸浮培養(yǎng)是將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。在脫水之前用ABA處理體細胞胚強迫其進入休眠，更有利于長期貯存。血清鑒定(serologic test) 試管沉淀反應(yīng)；免疫雙擴散；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA：利用抗體抗原反應(yīng)，將病毒制成抗體，再生植株葉片為抗原。產(chǎn)生因素：外植體種類與基因型有關(guān)，有些材料無論在什么條件下都不出現(xiàn)。這一途徑經(jīng)歷了組織培養(yǎng)技術(shù)的所有過程(愈傷組織誘導(dǎo)－愈傷組織增殖－芽分化－生根－完整植株)，它屬于真正意義上的組織培養(yǎng)。代謝途徑研究突