【正文】 因此它本身在自然界沒有競爭力。將分離的原生質體低速離心沉于離心管管底，用同樣的方法將細胞核或細胞器離心鋪于原生質體層上面，如此重復多次。1細胞核移植方法 核的分離 勻漿法：將要分離的材料置于組織搗碎機中進行勻漿，加入去污劑Triton X－100以溶解細胞膜及除去其它細胞質組分，從而釋放出細胞核，然后經(jīng)過濾離心，即可得到較為純凈的細胞核。細胞學鑒定：細胞器鑒定、染色體鑒定。電融合儀的結構特點： 交變電場部分 高頻直流電擊部分。PEG的作用機理： Kao等認為，由于PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成H鍵，從而在在原生質體之間形成分子橋，其結果是使原生質體發(fā)生粘連進而促使原生質體的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使原生質體的核、細胞器發(fā)生融合成為可能?；瘜W處理目前常用的試劑有，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質失活－羅丹明（R－6－G，它是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達到失活作用。 1原生質體融合類型根據(jù)融合時細胞的完整程度，原生質體融合可分為兩大類： 1細胞融合的意義理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。供體材料體類型 向日葵幼葉、子葉和下胚軸原生質體的培養(yǎng)，結果只有下胚軸原生質體培養(yǎng)后得到了細胞團和體細胞胚，而幼葉和子葉原生質體均未獲得成功。即：首先將愈傷組織培養(yǎng)于含低濃度生長素培養(yǎng)基上，讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)，再將其轉移到分化培養(yǎng)基上分化成苗。原生質體培養(yǎng)7～10天后必需及時添加新鮮培養(yǎng)基，否則形成的細胞團不繼續(xù)生長。 只有能形成完好細胞壁的再生細胞才能進入細胞分裂的階段。 瓊脂糖珠培養(yǎng) 將含有原生質體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50ml一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉培養(yǎng)。 缺點：是操作要求嚴格，尤其是混合時的溫度掌握必需合適，溫度偏高則影響原生質體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原生質體不易混合均勻。低融點的瓊脂糖可在30176。 優(yōu)點：操作簡單，對原生質體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉移培養(yǎng)物。 影響原生質體活力的因素 分離材料的生理狀態(tài)酶解條件：酶質量、濃度、酶解溫度、酶解時間、酶溶液的滲透壓分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時間環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響 原生質體培養(yǎng)基 大量元素濃度中注意 NO3－和NH4+的比例；Ca2+濃度；有機成分中含有維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 原生質體活力測定目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細胞形態(tài)、流動性確定原生質體活力。不同植物及材料類型預處理方法不同。原生質體研究的意義植物原生質體之所以能成為植物細胞工程的理想研究材料，是因為它具有以下重要特點：①易于從同一種植物材料的組織中獲得大量的遺傳上同一的游離原生質體，為植物細胞的遺傳操作的微生物化奠定了基礎；②可以像動物細胞一樣，被誘導與其他物種的原生質體融合，從而有效地克服了不同物種細胞之間的有性不親和障礙，為實現(xiàn)遠緣物種間的體細胞雜交，培育新種提供了新的手段；③它既可以捕獲外源DNA，也可以捕獲較大的細胞器，如病毒顆粒、葉綠體、線粒體等，因此是植物遺傳轉化的理想受體；④保持著植物細胞的全能性，在適宜的培養(yǎng)條件下，可以重新長出細胞壁，進行細胞分裂、分化，形成完整的小植株；⑤植物原生質體雖然沒有細胞壁，但仍然進行著植物細胞的各種生命活動，包括蛋白質和核酸的合成，光合作用，呼吸作用，通過膜向外界進行物質交換等。 1971年，Takebe et 。胞質體：不含細胞核而僅含有部分細胞質的原生質體。 一些試驗中還發(fā)現(xiàn)，體細胞胚發(fā)育后期降低蔗糖濃度，也有利于胚的繼續(xù)發(fā)育和提高體細胞胚的成苗率第三章 原生質體培養(yǎng)及體細胞雜交 原生質體的概念 原生質體：指除去細胞壁的細胞或是說一個被質膜所包圍的裸露細胞。2,4D的應用有規(guī)律性的變化，首先是在較高濃度下誘導胚性細胞的形成，然后在降低2,4D的濃度下產(chǎn)生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生長素有利于體細胞胚的繼續(xù)發(fā)育。 合子胚在胚胎發(fā)育完全進入子葉期胚以后，經(jīng)過一系列的物質積累和脫水就進入休眠，而體細胞胚則直接形成植株；在不同的培養(yǎng)條件和植株種類中，形成植株的胚胎時期有所不同，一般在心形期以后的各個階段均可直接發(fā)育成小植株。由花粉產(chǎn)生的單倍體胚狀體。其五，和培養(yǎng)物質沒有維管束聯(lián)系，所以容易從培養(yǎng)物質上剝離。連續(xù)的光照有利于培養(yǎng)細胞維管組織的形成，而一定的晝夜光照周期則有利于極性建立和形態(tài)發(fā)生。 外植體對誘導反應及其再生能力的影響體還現(xiàn)在生理狀態(tài)上 ，來源于生長活躍或生長潛力大的組織、器官的細胞更有利于培養(yǎng) 。胚性愈傷組織：具有產(chǎn)生胚狀體能力。 ？誘導腋芽。12. 植物的離體器官發(fā)生方式及過程離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程器官發(fā)生方式有先生芽后生根、先生根后生芽、根芽同時生長三種方式器官發(fā)生過程有經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程和不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生兩種過程。⒈通過愈傷組織分化芽，再分化根。在離體條件下，如果用生長素和細胞分裂素處理的順序不同，其作用也不一樣。通常把離體培養(yǎng)中TE（TE tracheary elements）細胞的出現(xiàn)作為組織分化的標志極性（polarity）所謂極性是指植物的器官、組織、甚至單個細胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結構以及生理生化上的梯度差異。 盡管細胞脫分化后進入細胞分裂的結果，在大多數(shù)情況下是形成愈傷組織，但絕不是說所有的細胞脫分化的結果都必然形成愈傷組織，許多試驗表明，有些外植體的細胞脫分化以后直接形成胚性細胞進而形成體細胞胚。細胞脫分化的調(diào)控機理細胞脫分化調(diào)控的實質即是G0期細胞回復到分裂周期的調(diào)控過程 細胞周期蛋白（cyclin）和依賴周期蛋白激酶(CDK cyclindependent kinase)是兩類主要的調(diào)控分子。胚狀體〔embroid〕:—對應于胚〔embryo〕，在離體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生一種形似胚（具有明顯的根端和芽端），功能與胚相同的結構。分化〔differentiation〕：細胞在分裂過程中發(fā)生結構和功能上的改變，從而在個發(fā)育中形成各類組織和器官完成整個生活周期。 細胞全能性的絕對性與相對性:不是所有基因型的所有細胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應。大量培養(yǎng)中可采用專門的通氣和攪拌裝置。在培養(yǎng)基中添加食鹽、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物質可以調(diào)整滲透壓。14..控制組培中形態(tài)建成的激素模型　　生長素與細胞分裂素的比例15..植物激素的主要生理作用　　影響培養(yǎng)中器官建成光照： 組織培養(yǎng)通常在散射光線下進行。.環(huán)境因素：光照：。降壓法即將植物材料與消毒液一起置于真空抽氣瓶中抽氣，以使消毒液滲入植物材料的表面，達到消毒的目的。接著用70％～75％的酒精漂洗植物材料數(shù)秒至半分鐘，以破壞有些植物材料蠟質化表面的張力。－修理。7. 培養(yǎng)方式%瓊脂、卡拉膠等，液體培養(yǎng)無凝固劑，分靜止、震蕩懸浮培養(yǎng)兩種懸浮培養(yǎng)成批、半成批、連續(xù)培養(yǎng)單細胞培養(yǎng)微室、平板、看護培養(yǎng)外植體（explant）是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織、器官等材料外植體的來源用于外植體分離的母體植物材料一般有三種來源： 一是生長在自然環(huán)境下的植物； 二是有目的培育、在溫室控制環(huán)境條件下生長的植物； 三是無菌環(huán)境下已經(jīng)離體培養(yǎng)的植物。包括C、H、O、N、P, K、Ca、Mg、 S 微量元素 微量元素的用量一般低于105～107克分子濃度。.Nitch無機鹽濃度高，White低鹽培養(yǎng)基，用于生根培養(yǎng)。培養(yǎng)基：濕熱滅菌，即高壓高溫蒸汽滅菌. 玻璃器皿：濕熱滅菌或干熱滅菌. 金屬器皿：干熱滅菌. 接種室：接種室常采用定期熏蒸，熏蒸劑常用甲醛加高錳酸鉀，一般每100ml甲醛加5g高錳酸鉀 MS無機鹽濃度高，微量元素種類齊全，養(yǎng)分均衡。細胞學實驗室 。要求封閉性好，干燥清潔，能較長時間保持無菌。　生理生化指標的測定等。種質資源的試管保存。通過原生質體融合獲得體細胞雜種和胞質雜種。3..植物組織培養(yǎng)技術的發(fā)展及意義： 1902年德國植物生理學家Haberlandt提出了“細胞的全能性”原理。細胞工程學習指導 高麗萍細胞工程學習指導緒 論1. 細胞工程學的概念 它是應用細胞生物學和分子生物學和分子生物學的理論和方法，按照人們的設計藍圖，在細胞水平上的遺傳操作及進行大規(guī)模的細胞和組織培養(yǎng)?！　　。íM義）組培指用植物各部分組織，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過再分化形成再生植物。擴大變異范圍：克服遠緣雜交后代不育性和雜交不親和性。一般選育自交系需4－6代花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株，染色體加倍后即為純合二倍體。器具的洗滌、干燥、消毒。外設緩沖間—。首要要求是要能控制光照和溫度，其次為防止微生物感染，培養(yǎng)室應保持干燥和清潔。 ，各有何利弊；；：易引起火災； 滅菌：適于不耐高溫材料。N6較高硝酸鹽、較低的銨鹽，禾本科花藥培養(yǎng)和柑橘類植物的花藥培養(yǎng)。無 機 鹽類大量元素培養(yǎng)基的使用量一般在每升幾十至幾千毫克?！　∽饔茫菏`水分、吸收化合物6．.常有哪些物質需過濾消毒IAA、ZT、GA3及某些維生素、抗生素、酶、植物提取物、秋水仙素等。這三種方法以第三種瓶內(nèi)轉移法最簡便、經(jīng)濟(節(jié)省培養(yǎng)基)和有效。12. 外植體滅菌方法一次消毒程序先將采集的植物材料用紗布或尼龍網(wǎng)扎緊瓶口置于流水條件下沖洗數(shù)小時。灼燒法消毒有的植物材料如胡蘿卜儲存根可采用，即將塊根于95％酒精中浸一下，置于酒精燈上灼燒，然后去除表面層，切取無菌韌皮部接種培養(yǎng)。培養(yǎng)基因素：無機鹽；有機化合物；植物激素；天然提取物；瓊脂；PH值；滲透壓；活性炭。⑷氣體。滲透壓：滲透壓對植物組織的生長和分化很有關系。小量懸浮培養(yǎng)時巨常轉動或振蕩，可起通氣和攪拌作用。條件是有生命力的核和完整的膜系統(tǒng)。外植體〔explant〕：從植物體上分離下來的用于離體培養(yǎng)的材料。愈傷組織〔callus〕:在離體培養(yǎng)過程中形成的具有分生能力的一團不規(guī)則細胞，多在外植體切面上產(chǎn)生。在這些變化中，液泡蛋白體的出現(xiàn)和質體轉變?yōu)樵|體被認為是細胞脫分化的重要特征。 細胞脫分化與愈傷組織形成細胞脫分化是細胞狀態(tài)的改變，但成功的脫分化必然會導致細胞分裂， 脫分化與愈傷組織的形成在性質上是不能等同的，脫分化是細胞生理狀態(tài)的改變，而形成愈傷組織是離體培養(yǎng)中的一個階段。 一個細胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)和機能，這是在時間上的分化； 同一種細胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)和機能，這是在空間上的分化從分化的遺傳控制角度講，細胞分化是各個處于不同時空條件下的細胞，基因表達與修飾差異的反應，所以，分化也可以說是相同基因型的細胞由于基因選擇性表達所反應的各種不同的表現(xiàn)型。在眾多植物離體培養(yǎng)中證明，細胞分裂素和生長素對于細胞生長和分化具有同等重要的協(xié)同作用，它們的量與比值的不同配合，對細胞分化起著重要調(diào)節(jié)作用。?固體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)，半固體培養(yǎng)，雙層培養(yǎng)。⒋外植體直接產(chǎn)生胚狀體。這種不經(jīng)過愈傷組織直接發(fā)生器官的途徑在以品種繁殖為目的的離體培養(yǎng)中具有重要的實踐意義。14..愈傷組織類型及特征結構致密型：表面光滑有光澤，結構致密，多為淡黃色或白色，易于再生芽結構松散型：多為白色，可以用于懸浮系建立。 基因型對于培養(yǎng)反應的差異，器官分化能力的差異大于愈傷組織誘導的差異。 光照是離體培養(yǎng)中比較復雜的調(diào)節(jié)因子，光照時間、強度以及光質對器官分化均有影響。 光質對器官分化的影響可能與光受體精確調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細胞是體細胞還是生殖細胞）其一，體細胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)別于無融合生殖胚；其二，體細胞胚起源于非合子細胞，單細胞起源，以區(qū)別于合子胚； 其三，體細胞發(fā)育程序同合子胚相似，經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，也經(jīng)過球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚，以區(qū)別與離體培養(yǎng)中器官發(fā)生形成個體的途徑其四，和周圍細胞之間有隔離。間接胚狀體發(fā)生經(jīng)過愈傷組織的體細胞胚形成，或經(jīng)過懸浮細胞的體細胞胚形成。與合子胚比較： 合子胚在發(fā)育初期具有明顯的胚柄，而體細胞胚一般沒有真正的胚柄只有類似胚柄的結構； 合子胚的子葉是相當規(guī)范的，可以作為分類的依據(jù)，體細胞胚的子葉常不規(guī)范；與相同植物比較體細胞胚的體積明顯小于合子胚；在一些貯藏物質的含量上也存在較大差異；并且，體細胞胚不能有明顯的脫水干燥過程。激素的調(diào)控作用2,4D是應用最為廣泛的生長素。 培養(yǎng)基中的氮源亦會顯著影響離體條件下的胚胎發(fā)生，一些氨基酸可以代替還原態(tài)氮的作用，一些體細胞胚規(guī)模生產(chǎn)模式的試驗還發(fā)現(xiàn)，球形胚形成后，如果降低培養(yǎng)基無機鹽濃度，可以顯著促進體細胞胚的進一步發(fā)育。它可以具有細胞核或沒