【正文】 麥效果不穩(wěn)定，有時(shí)還有負(fù)效果。 適當(dāng)?shù)念A(yù)處理可以顯著提高花藥的愈傷組織誘導(dǎo)率。常用的預(yù)處理方法是低溫冷藏，具體的處理溫度和時(shí)間長度因物種而異：煙草7～9℃，7～14 d；水稻7～1O℃，10～15 d；黑麥1～3℃，7～14 d；大麥3～7℃，7～14 d。但低溫預(yù)處理對(duì)小麥效果不穩(wěn)定，有時(shí)還有負(fù)效果。 消毒花藥適宜培養(yǎng)時(shí)，花蕾尚未開放，花藥在花被或穎片的嚴(yán)密包被之中，本身處于無菌狀態(tài)，因此，通常只要以70% 酒精噴灑或擦拭花器或包被著麥穗的葉鞘表面，即可達(dá)到滅菌要求。接種把雄蕊上的花藥輕輕地從花絲上摘下，水平地放在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在整個(gè)操作過程中不應(yīng)使花藥受到損傷，若受損傷，則應(yīng)淘汰，因?yàn)閾p傷常常會(huì)刺激花藥壁形成二倍體愈傷組織。 如果所碰到的是花器很小的植物，如天門冬屬、蕓苔屬和三葉草屬植物等，可能需要借助解剖鏡夾取花藥，或是只把花被去掉，把花蕾的其余部分連同其中原封未動(dòng)的雄蕊一起接種在培養(yǎng)基上 .由于花藥對(duì)離體培養(yǎng)的反應(yīng)存在“密度效應(yīng)”，因此每個(gè)容器中接種的花藥數(shù)量不宜太少，以形成一個(gè)合理的群體密度。 培養(yǎng)方式1) 在瓊脂固化培養(yǎng)基表面培養(yǎng)。2) 在加人30％Ficoll的液體培養(yǎng)基表面飄浮培養(yǎng)。3) 利用固體一液體雙層培養(yǎng)基培養(yǎng)，以便既能保持較高的接種密度，培養(yǎng)基又不易失水干涸。培養(yǎng)條件對(duì)于大多數(shù)小麥品種來說，在培養(yǎng)的最初6d給以30～32 ℃的較高溫度，然后再轉(zhuǎn)入28～30℃下培養(yǎng)，花藥出愈率會(huì)有明顯提高。水稻花藥培養(yǎng)的適宜溫度從一開始就是27℃。 對(duì)光照的要求在物種間差異更為明顯，例如連續(xù)光照可顯著增加煙草花粉胚的產(chǎn)量，卻強(qiáng)烈抑制曼陀羅的花粉胚胎發(fā)生。禾谷類植物在花粉愈傷組織誘導(dǎo)期間則以暗培養(yǎng)或散射光培養(yǎng)效果較好，強(qiáng)光會(huì)抑制小麥花粉愈傷組織的形成。 愈傷組織的分化原則上都應(yīng)在光照下進(jìn)行，但對(duì)光照強(qiáng)度和照光時(shí)間的要求則因物種而異。例如水稻花粉愈傷組織在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基之初仍不宜照光培養(yǎng)，須待3～5d后再給以每天14h 1000～2 000lx的光照，以免引起愈傷組織的老化壞死。對(duì)小麥花粉植株則不宜給以長日照。 壯苗和移栽以小麥為例，王培等采用的方法是：將已長出2～3片葉的花粉植株轉(zhuǎn)入含有多效唑3 mg／L，NAA和KT各O．5 mg／L，LH500mg／L和蔗糖8％的MS培養(yǎng)基上，于22～25℃下進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，然后在3～8 ℃低溫弱光條件下越夏，深秋時(shí)煉苗移栽。 單倍體植株的二倍化單倍體植株能正常地生長到開花期，但由于缺少同源染色體，減數(shù)分裂不能正常進(jìn)行，因而不能形成有活力的配子。秋水仙素處理誘導(dǎo)染色體加倍 (1)禾本科植物，一般都是在分蘗盛期用秋水仙素溶液浸泡分蘗節(jié)，% 秋水仙素處理8h，水稻，％的秋水仙素處理24h。為了增強(qiáng)處理效果，溶液內(nèi)皆須加人1％～2％的助滲劑二甲基亞砜(DMSO)。 (2)把含有秋水仙素的羊毛脂涂于上部葉片的腋芽上，然后把主莖的頂芽去掉，以刺激側(cè)芽長成二倍體的可育枝條。（3）采用愈傷組織和試管苗染色體加倍。％秋水仙素溶液中96h（煙草），然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上使其進(jìn)一步生長。三、影響雄核發(fā)育的因子雄核發(fā)育指小孢子沿孢子體途徑發(fā)育成花粉植株的過程。 1 基因型 陳錦驊等(1982)報(bào)道，水稻不同種、亞種和品種間花藥對(duì)離體培養(yǎng)反應(yīng)的高低順序是：糯粳粳／秈秈／秈秈。在粳稻中花粉愈傷組織誘導(dǎo)率平均可達(dá)10％，而在秈粳中只有1 %～2％。2 生理狀態(tài) 幼年植株的花藥反應(yīng)能力較好，在開花末季采集的花藥不但形成孢子體的頻率很低，而且發(fā)生反應(yīng)的時(shí)間也較遲。在水稻和小麥等禾谷類植物中，大田植株比溫室植株、主莖穗比分蘗穗花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率高 王敬駒等(1974)看到，在水稻中若在10℃下用乙烯利預(yù)處理植株84h，可增加花藥對(duì)培養(yǎng)的反應(yīng)能力。 3 花粉發(fā)育時(shí)期一般而言單核后期花藥對(duì)培養(yǎng)反應(yīng)較好，但不同物種最適的發(fā)育時(shí)期不同 。例如，在毛曼陀羅、煙草中，最適時(shí)期是在花粉第一次有絲分裂的當(dāng)時(shí)或稍前稍后。而在顛茄和林生煙草中以雙細(xì)胞早期最好，在金氏煙草中雙細(xì)胞早期則是絕對(duì)必要。很多禾本科植物的花藥是在單核早期(大麥)或單核中、晚期反應(yīng)最好。 檢查花粉發(fā)育時(shí)期常用的方法是醋酸洋紅染色，但對(duì)于DNA含量較低的材料，最好用孚爾根試劑染色。此外，對(duì)水稻和玉米等植物而言，IKI染色效果比醋酸洋紅更好. 4 藥壁因子在花粉胚發(fā)育過程中花藥壁起著重要的作用?；ㄋ帉?duì)同一物種及不同物種離體花粉雄核發(fā)育有看護(hù)作用。甚至花藥浸提液也能刺激花粉胚的形成。在大麥花藥漂浮培養(yǎng)中，若使用曾經(jīng)培養(yǎng)過大麥花藥或子房7d的條件培養(yǎng)基，能顯著促進(jìn)花粉胚的形成。在曼陀羅離體小孢子培養(yǎng)中，用谷氨酰胺、絲氨酸和肌醇三者一起可以取代藥壁因子的作用，而在煙草花粉培養(yǎng)中，只用谷氨酰胺即能取代這種作用。5 培養(yǎng)基（1） 基本培養(yǎng)基MS，Miller和Nitsch培養(yǎng)基等對(duì)花藥培養(yǎng)普遍適用。N6培養(yǎng)基(朱至清等，1974)適用于稻、麥和玉米，C17培養(yǎng)基(王培等，1986)適用于小麥 ， N C17提高了禾谷類植物花粉形成愈傷組織和愈傷組織分化綠苗的頻率。(2) 碳源最常用的碳源是蔗糖。麥芽糖、果糖和葡萄糖也取得了良好的培養(yǎng)效果。由于不同植物花粉細(xì)胞的滲透壓不同，對(duì)蔗糖濃度的要求也不同。此外，花粉細(xì)胞的滲透壓通常高于花絲等體細(xì)胞的滲透壓，因此所用的蔗糖濃度最好能在不妨礙花粉細(xì)胞增殖的同時(shí)，又能抑制體細(xì)胞的增殖。 煙草、油菜、甜椒和柑橘等蔗糖濃度為3％，水稻3％～6 %，小麥6％～10 %，大麥和黑麥草12％，玉米12％～15％。 （3）植物激素花藥在離體培養(yǎng)中對(duì)激素的要求有2種不同的情況：煙草、毛曼陀羅等雄核發(fā)育的途徑是直接形成花粉胚。一般不需要激素，在基本培養(yǎng)基上就可以產(chǎn)生完整的單倍體植株。在大多數(shù)已知能進(jìn)行雄核發(fā)育的非茄科物種中，花粉粒首先形成愈傷組織，然后，由愈傷組織分化出孢子體。在這些植物中，為了誘導(dǎo)花藥進(jìn)行雄核發(fā)育，必須單獨(dú)地或以不同配比在培養(yǎng)基中加入生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、復(fù)雜的營養(yǎng)混合物(如酵母浸出液，水解酪蛋白)和椰子汁等。在大多數(shù)禾本科植物如水稻、小麥、大麥的花藥培養(yǎng)中，外源生長素，特別是2，4一D(13 mg／L)，是啟動(dòng)小孢子細(xì)胞分裂形成愈傷組織的必要條件。（4）活性炭在煙草花藥培養(yǎng)基中添加1％活性炭，％活性炭，都能大幅度提高花粉植株的形成頻率 .四、禾谷類植物花藥培養(yǎng)中白化苗的形成在大麥、小麥和水稻的花粉植株中，白化苗通常要占總苗數(shù)的1／3以上，嚴(yán)重的情況下，例如在大麥品種Sabarlis的花粉植株中白化苗頻率可高達(dá)60％～90％。在水稻中造成白化的原因是由于前質(zhì)體不能正常地發(fā)育成葉綠體，既不能形成基粒又完全缺乏核糖體?，F(xiàn)只知道白化苗的形成受溫度的影響，當(dāng)溫度由26℃增加到35℃時(shí)，白化苗的數(shù)目也隨之增加。Genovesi等(1979)在水稻上還觀察到，花粉處在單核期的花藥若在10℃和13 ℃下冷處理3～14 d，所產(chǎn)生的植株中有90％是綠苗。然而，無論在10℃或13 ℃下，若把冷處理的時(shí)間延長到21 d，所產(chǎn)生的植株幾乎全是白化苗，花粉處在雙核期的花藥比處在單核期的花藥產(chǎn)生的白化苗較多。除葡萄外，在禾本科以外植物的花藥培養(yǎng)中未曾發(fā)現(xiàn)過白化苗 。五、離體花粉培養(yǎng)花藥培養(yǎng)存在的問題 由于一個(gè)花藥內(nèi)的花粉粒在遺傳上是異質(zhì)的，因此，由一 個(gè)花藥所產(chǎn)生的植株，將構(gòu)成一個(gè)異質(zhì)的群體。單倍體植株若是經(jīng)由花粉愈傷組織的途徑產(chǎn)生的，由于從若干花粉起源的愈傷組織常常混在一起，因此由一個(gè)花藥形成的愈傷組織將會(huì)是一個(gè)嵌合體。 在花粉愈傷組織化的同時(shí)，花藥壁細(xì)胞也進(jìn)行增殖，最終所得到的愈傷組織就不可能具有純粹的配子體起源 。Tulecke（1953年）報(bào)道了裸子植物花粉離體培養(yǎng)形成愈傷組織。 Kameya和Hinata(1970)報(bào)道甘藍(lán)和甘藍(lán)芥藍(lán)雜種的成熟花粉離體培養(yǎng)形成愈傷組織。培養(yǎng)方法為懸滴培養(yǎng)法。為了防止花粉破裂，在4℃下的低溫中接種，在20℃下暗培養(yǎng)。 Sharp等(1972)用看護(hù)培養(yǎng)法培養(yǎng)番茄的離體花粉粒，也成功地獲得了單倍體細(xì)胞的無性繁殖系 。第十一章 細(xì) 胞 培 養(yǎng)? 1902年，Haberlandt提出了植物細(xì)胞全能性概念，認(rèn)為植物細(xì)胞具有再生成為完整植株的潛在全能性，首次提出分離植物單細(xì)胞,并將其培養(yǎng)成植株的設(shè)想。1954年，Muir首次成功地進(jìn)行了植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。? 20世紀(jì)80年代以來植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)迅速發(fā)展，已經(jīng)成為生物工程研究開發(fā)的新熱點(diǎn)。迄今為止，已經(jīng)獲得400多種植物的細(xì)胞，不僅可以通過細(xì)胞的再分化生成完整的植株，而且可以通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得600多種人們所需的各種物質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)的意義? 植物細(xì)胞培養(yǎng)可用于生產(chǎn)色素、藥物、香精、酶等次生代謝物。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物具有提高產(chǎn)率、縮短周期、提高產(chǎn)品質(zhì)量等顯著特點(diǎn)，且不占用耕地，不受地理環(huán)境和氣候條件等的影響，對(duì)于農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)具有深遠(yuǎn)的意義。? 通過單細(xì)胞的克隆化，可以把微生物遺傳學(xué)技術(shù)用于高等植物，以進(jìn)行農(nóng)作物的改良。一、植物細(xì)胞的獲取? （一）由完整的植物器官分離單細(xì)胞? 機(jī)械法： ? （1）先撕去葉表皮，使葉肉細(xì)胞暴露，再用小解剖刀把細(xì)胞刮下來。這些離體細(xì)胞可直接在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。? （2）先把葉片輕輕研碎，然后再通過過濾和離心把細(xì)胞凈化。 ? 優(yōu)點(diǎn)：①細(xì)胞不至受到酶的傷害作用；②無需質(zhì)壁分離? 酶解法? Takebe等人(1968)最早報(bào)道，在煙草中通過果膠酶處理,大量分離具有代謝活性的葉肉細(xì)胞。在用酶解法分離細(xì)胞的時(shí)候，必須對(duì)細(xì)胞給予滲透壓保護(hù)。（二） 通過愈傷組織誘導(dǎo)獲取植物細(xì)胞把未分化的和易散碎的愈傷組織轉(zhuǎn)移到裝有30～50 ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在25C177。1 ℃，弱光或黑暗中，將三角瓶置于搖床上不斷振蕩(120 r／min)。初期每10 d左右用新鮮培養(yǎng)液更換掉三角瓶中大約4／5的舊液.二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法? 按照培養(yǎng)基條件分為? 固體培養(yǎng)：指細(xì)胞在含有瓊脂的固體培養(yǎng)基上生長繁殖的培養(yǎng)過程。固體培養(yǎng)在細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)的篩選、誘變，原生質(zhì)體培養(yǎng)等方面廣泛使用。? 液體培養(yǎng)：又分為液體薄層靜止培養(yǎng)和液體懸浮培養(yǎng)等。? 按照培養(yǎng)對(duì)象的不同可分為? 愈傷組織培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)、單倍體細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、固定化細(xì)胞培養(yǎng)、小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)等。（一） 液體懸浮培養(yǎng) 分批培養(yǎng)容器一般是100～250 ml三角瓶，每瓶中裝有20～75 ml培養(yǎng)基。為了使分批培養(yǎng)的細(xì)胞能不斷增殖，必須進(jìn)行繼代。方法是取出培養(yǎng)瓶中一小部分懸浮液，轉(zhuǎn)移到成分相同的新鮮培養(yǎng)基中(大約稀釋5倍)。在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞數(shù)目增長的變化表現(xiàn)為一條S形曲線。分批培養(yǎng)是當(dāng)今植物懸浮培養(yǎng)最常用的方式，但是分批培養(yǎng)方式的生產(chǎn)周期較長，設(shè)備利用率較低。 連續(xù)培養(yǎng) 封閉型連續(xù)培養(yǎng)：排出的舊培養(yǎng)基由加入的新培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)充，進(jìn)出數(shù)量保持平衡。懸浮在排出液中的細(xì)胞經(jīng)機(jī)械方法收集起來之后，又被放回到培養(yǎng)系統(tǒng)中。因此，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)目不斷增加。開放型連續(xù)培養(yǎng) ：注入的新鮮培養(yǎng)液的容積與流出的原有培養(yǎng)液容積相等，并通過調(diào)節(jié)流入與流出的速度，使培養(yǎng)物的生長速度永遠(yuǎn)保持在一個(gè)接近最高值的恒定水平上?？煞譃閮煞N主要方式：一是化學(xué)恒定式；二是濁度恒定式。 半連續(xù)培養(yǎng) 在培養(yǎng)過程中，每隔一段時(shí)間從反應(yīng)器中放出部分培養(yǎng)液，并補(bǔ)充部分新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方式。半連續(xù)培養(yǎng)可以提高設(shè)備利用率，可以適當(dāng)提高單位體積反應(yīng)器的產(chǎn)量。但在添加新鮮培養(yǎng)基的時(shí)候，要注意防止微生物的污染。 （二）單細(xì)胞培養(yǎng)平板培養(yǎng)法 將含有游離細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的懸浮培養(yǎng)物過濾，棄去大的細(xì)胞團(tuán)，留下游離細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)。把與液體培養(yǎng)基成分相同但加入 ％～1%瓊脂的培養(yǎng)基加熱，使瓊脂融化，然后冷卻到35℃，將培養(yǎng)基和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液等量混合，迅速注入并使之鋪展在培養(yǎng)皿中。 看護(hù)培養(yǎng)法 最初是由Muir等人(1954)設(shè)計(jì)的。把單個(gè)細(xì)胞置于一塊活躍生長的愈傷組織上進(jìn)行培養(yǎng)，在愈傷組織和培養(yǎng)的細(xì)胞之間，有一片濾紙相隔。愈傷組織和所要培養(yǎng)的細(xì)胞可以屬于同一個(gè)物種，也可以是不同的物種。 微室培養(yǎng)法 由Jones等人(1960)設(shè)計(jì) 。主要優(yōu)點(diǎn)是在培養(yǎng)過程中可以連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，把一個(gè)細(xì)胞的生長、分裂和形成細(xì)胞團(tuán)的全部過程記錄下來。 4．條件培養(yǎng)法 條件培養(yǎng)基是指含有植物細(xì)胞培養(yǎng)上清液或靜止細(xì)胞的培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)是將單細(xì)胞接種于條件培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使單細(xì)胞生長繁殖。 基本過程如下植物細(xì)胞培養(yǎng)上清液或靜止細(xì)胞懸浮液的配制 先將群體細(xì)胞或者細(xì)胞團(tuán)接種于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng) ，將培養(yǎng)液移入離心管中進(jìn)行離心分離，分別得到植物細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞沉淀。細(xì)胞沉淀在60℃條件下處理30 min，得到?jīng)]有生長繁殖能力的細(xì)胞，即為靜止細(xì)胞。將靜止細(xì)胞懸浮于一定量的無菌水中，得到靜止細(xì)胞懸浮液。條件培養(yǎng)基的配制 將植物細(xì)胞培養(yǎng)上清液或者靜止細(xì)胞懸浮液與50℃％瓊脂的固體培養(yǎng)基混合均勻。接種：a 將一小片濾紙置于條件培養(yǎng)基上，再在濾紙上方接種單細(xì)胞；b 將單細(xì)胞直接接種于條件培養(yǎng)基的表面；c 在配制條件培養(yǎng)基時(shí)，取一定量的單細(xì)胞懸浮液一起加入，混勻而成。d 先配制好條件培養(yǎng)基，待其凝固后，再在條件培養(yǎng)基的上面鋪上一層含有單細(xì)胞的固體培養(yǎng)基。(三) 固定化細(xì)胞培養(yǎng) 固定化細(xì)胞指固定在載體上、在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。1979年，Brodelius等人開創(chuàng)了植物細(xì)胞固定化的研究。與植物浮培養(yǎng)比較，固定化植物細(xì)胞具有穩(wěn)定性好、產(chǎn)物容易分離、利于連續(xù)化生產(chǎn)等特點(diǎn)。但是只適用于可以分泌到細(xì)胞外的次級(jí)代謝物生產(chǎn)。 植物細(xì)胞固定化的方法 （1）吸附法 ：將植物細(xì)胞吸附在多孔的陶瓷、玻璃、塑料大孔隙或裂縫之中，也可將植物細(xì)胞吸附在中空纖維的外壁。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便易行，對(duì)細(xì)胞的生長、繁殖和新陳代謝沒有明顯的影響。缺點(diǎn)：吸附力較弱，吸附不牢固，細(xì)胞容易脫落。 （2）包埋法