【正文】 、其他添加物 ：酵母提取物，椰乳，香蕉粉，橘子汁，活性炭，滲透調(diào)節(jié)劑、水解酪蛋白、水解乳蛋白等?；钚蕴窟€有刺激胚胎發(fā)生(如煙草花藥培養(yǎng))或組織生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生的作用。3．抗生素：培養(yǎng)的植物組織內(nèi)部攜帶有病原物，表面消毒不解決問題時(shí)，可在配置培養(yǎng)基時(shí)添加抗生素，如加200～300U的慶大霉素可使細(xì)菌污染受到很好的控制。 三、培養(yǎng)基的配制 （一）、配制母液（二）、配制培養(yǎng)基 (三)、配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意的有關(guān)問題 高溫滅菌的基本過程 檢查滅菌鍋內(nèi)有無足夠量的水，最好用蒸餾水或去離子水，因?yàn)樽詠硭休^多的礦物質(zhì)，容易使鍋內(nèi)形成水垢，影響鍋的使用壽命。 高溫下培養(yǎng)基成分的降解 經(jīng)高溫滅菌后赤霉素GA3的活性僅及不經(jīng)高溫滅菌的新鮮溶液的10％。蔗糖經(jīng)高溫后部分被降解成D葡萄糖和D果糖，果糖又可被部分水解，產(chǎn)生抑制培養(yǎng)的植物組織生長(zhǎng)的物質(zhì)。維生素具有不同程度的熱穩(wěn)定性，則維生素B1會(huì)被迅速降解。適合于干熱滅菌的器皿和物品有：①玻璃器皿，如三角瓶、燒杯、量筒等；②金屬物品，如鑷子、解剖刀、剪刀等；③可以高溫滅菌的塑料制品。滅菌的溫度為121℃， kPa，滅菌時(shí)間除液體外要求在121℃下維持15 min以上。 濕熱滅菌時(shí)應(yīng)注意以下問題：不能隨意延長(zhǎng)滅菌時(shí)間，因?yàn)檠娱L(zhǎng)時(shí)間會(huì)使一些化合物過多分解，特別是蔗糖會(huì)分解為單糖，使培養(yǎng)基pH降低，瓊脂不能很好的凝固；如果滅菌鍋沒有吹干程序，從鍋內(nèi)取出的紙制品、紗布等最好立即轉(zhuǎn)到60℃的溫箱中吹干；由于錫箔紙不透氣，推薦使用牛皮紙或報(bào)紙等包裝物品，以利于水分快速蒸發(fā)；滅菌鍋所裝蒸餾水或去離子水應(yīng)經(jīng)常更換，以防止微生物污染和水中雜質(zhì)過多，給滅菌鍋和要滅菌的物品帶來不利影響； 三、微過濾滅菌是使需要滅菌的液體通過一個(gè)微孔濾膜，以除去液體中的微生物、微顆粒等，～lO181。這種方法對(duì)于高溫滅菌容易引起分解的物質(zhì)最為適宜，如容易分解的維生素、激素、植物組織提取物、抗生素等。如要獲得原生質(zhì)體。使用時(shí)取出鑷子或解剖刀，放在酒精燈上加熱至酒精完全除去為止，用完后再放回75%酒精中。在超凈工作臺(tái)上，將材料在70％酒精中進(jìn)行表面預(yù)消毒30秒，倒掉酒精，％升汞(HgCl2)進(jìn)行消毒8分鐘左右，或用1％次氯酸鈉(NaOCl)或次氯酸鈣Ca(OCl)2消毒20 min左右，具體時(shí)間要根據(jù)材料而定。；通常往消毒液中添加幾滴吐溫20或吐溫80等表面活性劑，以提高滅菌效果?？股氐氖褂弥荒苁怯米黝A(yù)防微生物污染的方法，而不能用于殺死微生物，因此在使用時(shí)最好加在培養(yǎng)基當(dāng)中，而不宜作為一種殺菌劑單獨(dú)使用。六、無菌操作中其他應(yīng)注意的問題 注意防止紫外線的危害 植物組織培養(yǎng)室和超凈工作臺(tái)上的紫外燈開放時(shí)間不可太長(zhǎng)，最好在30min之內(nèi)。 第七章 離體快速繁殖方法微繁——在無菌條件下進(jìn)行植物的無性繁殖。使微繁技術(shù)真正實(shí)用化。 注意：（1）、在生長(zhǎng)季節(jié)開始時(shí)由活躍生長(zhǎng)的枝條上切取的外植體，通常能產(chǎn)生最好的效果。消毒二、莖芽的增殖（一）莖芽增殖的類型器官型(organ type) 以芽增殖芽的方法，其遺傳性狀穩(wěn)定，成為目前快速繁殖中采用的主要方法。胚狀體發(fā)生型(embryoid type) 體細(xì)胞增殖發(fā)育的順序與受精卵發(fā)育極為相似，經(jīng)過原胚一球形胚一心形胚一魚雷胚一子葉胚5個(gè)時(shí)期，最后發(fā)育成完整的植株。通過胚狀體的培養(yǎng)可以獲得大量的植株，大大提高繁殖率原球莖型(protoeomb type) 目前蘭花的快速繁殖主要靠原球莖的分化方式。 6 塊莖型(tuber type) 花葉芋的葉片或葉柄上，先形成類似愈傷組織的小硬粒突起，并逐漸形成粒狀的芋塊。由小突起上分化出芽原基。 7 鱗莖型(bulb type) 百合的鱗莖切塊基部近軸面或在邊緣直接形成帶根的小鱗莖。郁金香鱗莖旁又會(huì)分化出小鱗莖。在禾谷類植物中，只用2，4一D就能成功地誘導(dǎo)愈傷組織。黑暗條件下有利于愈傷組織的形成，光照對(duì)組織的愈傷化有抑制作用。（4）經(jīng)過長(zhǎng)期繼代保存不喪失胚性，以便對(duì)它們進(jìn)行各種遺傳操作。如禾谷類植物愈傷組織培養(yǎng)的成功，是由于選擇了未成熟胚和幼穗作為外植體，它們的根和幼葉雖然也能形成愈傷組織，但都是非胚性的。 （3）采用某些特殊的理化因素，改變愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。（4）還原態(tài)氮具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，硝態(tài)氮具有抑制細(xì)胞分裂的作用。 3 影響莖芽分化的因素 化學(xué)因素 （1）細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素 在莖芽誘導(dǎo)中，2ip在通常情況下是最為有效的。當(dāng)與激動(dòng)素或腺嘌呤結(jié)合使用時(shí)，生長(zhǎng)素可以抵消它們促進(jìn)莖芽形成的作用。 物理因素 （1）瓊脂濃度： 在培養(yǎng)煙草薄層組織時(shí)，當(dāng)瓊脂為l％時(shí)，只能形成花；隨著瓊脂濃度的下降，花的形成頻率減少，營(yíng)養(yǎng)芽的分化出現(xiàn)。 （3）光照： 高強(qiáng)度的光照對(duì)煙草莖芽的形成有抑制作用。光質(zhì)對(duì)器官分化也有影響。 （4）溫度： Skoog(1944)在5～33℃的范圍內(nèi)研究了溫度對(duì)煙草愈傷組織生長(zhǎng)和分化的影響，發(fā)現(xiàn)直到33℃時(shí)愈傷組織的生長(zhǎng)都隨溫度的上升而增加，但只有在18℃時(shí)最適合莖芽的分化，在33℃時(shí)不能形成莖芽。 （三）影響莖芽增殖的因素?zé)o機(jī)鹽水平 對(duì)有些植物來說，MS培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽水平或有毒或太高。激素 CTK 為了獲得健壯的莖芽應(yīng)適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素濃度。GA 為促使莖的伸長(zhǎng)，有時(shí)加入GA； 生長(zhǎng)素 在進(jìn)行莖芽繁殖時(shí)，IAA、～1mg／L。但在卡特蘭和大多數(shù)鳳梨科植物中，只有在液體培養(yǎng)基中才能把培養(yǎng)建立起來。光照和溫度光的作用只是滿足某些形態(tài)發(fā)生過程的需要，因此1000～5000 lx的光強(qiáng)即已足夠。每天16 h光照／8 h黑暗交替照明，即可產(chǎn)生令人滿意的效果。 三、離體枝條的生根 試管內(nèi)生根 1）生根培養(yǎng)基應(yīng)降低鹽的濃度，減少到1／2MS或1／4MS。3）對(duì)于難生根的植物，可嘗試把它們的下端浸在高濃度生長(zhǎng)素溶液中若干時(shí)間(由幾秒到幾小時(shí))之后，再插于無激素培養(yǎng)基中。5）枝條在離體條件下生根所需的時(shí)間由10d到15d不等。 試管外生根 在有些植物中，可以把在離體條件下形成的枝條當(dāng)做微插條處理，使它們?cè)谕林猩?。試管外生根由于減少了一個(gè)無菌操作步驟，因而可降低成本。 試管外嫁接: 無籽西瓜試管苗嫁接到瓠子上后，在溫度為25～30℃，相對(duì)濕度基本飽和的條件下，3d后傷口長(zhǎng)出愈傷組織，1周后成活并長(zhǎng)出新葉。這樣的試管苗若未經(jīng)充分鍛煉，一旦被移出試管，投入到一個(gè)變溫、低濕、強(qiáng)光、有菌和缺少完全營(yíng)養(yǎng)的條件下，必定要被劇變的環(huán)境所吞噬。煉苗： 壯苗之后則須開瓶，降低瓶中濕度，增強(qiáng)光照強(qiáng)度，以便促使葉表面逐漸形成角質(zhì)，促使氣孔逐漸建立開閉機(jī)制，促使葉片逐漸啟動(dòng)光合功能等。要選用排水性和透氣性良好的移栽介質(zhì)，例如蛭石、河沙、珍珠巖、腐植土等。 五、微繁中存在的一些問題 物種的局限性很多難于用傳統(tǒng)方法繁殖的重要樹木，包括若干裸子植物，離體繁殖技術(shù)還未過關(guān)。如果是通過愈傷組織進(jìn)行微繁的話，經(jīng)過長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)之后，再生植株中出現(xiàn)變異的可能性更大。玻璃化玻璃化現(xiàn)象是植物組織培養(yǎng)過程中特有的一種生理失調(diào)或生理病變，多數(shù)發(fā)生在植物莖尖培養(yǎng)和離體快繁中。玻璃化的誘因 外植體類型、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等各種內(nèi)外因素都可能是玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn)的原因，其中比較重要的如瓊脂用量太低或細(xì)胞分裂素濃度過高，培養(yǎng)溫度過高，光照不足以及乙烯合成增加等。 克服培養(yǎng)基褐變的措施 以幾天的時(shí)間間隔將外植體轉(zhuǎn)到新鮮培養(yǎng)基上2～3次，在這段時(shí)間內(nèi)外植體的切口愈合，酚類物質(zhì)外滲停止。或于接種的第一個(gè)星期之內(nèi)，每天更換一次液體培養(yǎng)基 。 使用能夠吸收酚類化合物的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，％)、活性炭(％～％) 。適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度。 胚狀體的特點(diǎn)： 不是兩性細(xì)胞融合的產(chǎn)物； 不同于孤雌胚或孤雄胚，不是無融合生殖的產(chǎn)物；不同于器官發(fā)生途徑形成的莖芽和根，它的形成須經(jīng)歷與合子胚相似的發(fā)育過程，而且成熟的胚狀體是一個(gè)雙極性結(jié)構(gòu)。 迄今已在分屬于40余科（包括裸子植物）的100多個(gè)種植物中有過關(guān)于體細(xì)胞胚胎發(fā)生的報(bào)道。三、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方式 從培養(yǎng)中的器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體直接分化成胚，中間不經(jīng)過愈傷組織階段，如石龍芮再生植株莖表面長(zhǎng)出不定胚。 A、由外植體外層細(xì)胞直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚 B、由外植體組織內(nèi)的細(xì)胞產(chǎn)生體細(xì)胞胚C、愈傷組織表層細(xì)胞分化為體細(xì)胞胚 D，E、多個(gè)或單個(gè)細(xì)胞形成體細(xì)胞胚 四、體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生研究的意義 （1）植物細(xì)胞分化、全能性表達(dá)過程和機(jī)理等重大理論問題的研究提供了理想的實(shí)驗(yàn)體系 ；（2）人工種子的制作，是促進(jìn)離體快速繁殖、實(shí)現(xiàn)田間和溫室栽培的重要途徑；（3）胚性愈傷組織可在適宜的條件下長(zhǎng)期保存，為解決瀕危植物挽救等問題提供了可能；（4）胚性愈傷組織具有遺傳穩(wěn)定、再生頻率高的特點(diǎn)，對(duì)于基因工程非常適用； （5）體胚發(fā)生過程中眾多體細(xì)胞無性系變異為突變體的篩選提供了新的來源； (6)以胚性細(xì)胞為材料制備原生質(zhì)體，為細(xì)胞分化和植株再生等奠定了基礎(chǔ)。甚至外植體形態(tài)學(xué)部位也是影響因素之一。而幼嫩的營(yíng)養(yǎng)器官則一般需經(jīng)愈傷組織途徑產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎。培養(yǎng)基種類及其成分培養(yǎng)基種類 體胚誘導(dǎo)中70％采用MS培養(yǎng)基。對(duì)體胚發(fā)生有促進(jìn)作用。在以KN03為唯一氮源的培養(yǎng)基上建立起來的愈傷組織，去掉生長(zhǎng)素以后不能形成胚。 碳源 作為外植體的滲透壓調(diào)節(jié)物和體胚發(fā)育的能源物質(zhì)，碳源對(duì)體胚發(fā)生有重要影響。蘋果離體葉片培養(yǎng)時(shí)，在保證碳源供應(yīng)的前提下，降低蔗糖濃度有利于直接體胚發(fā)生。培養(yǎng)基中溶解氧 在培養(yǎng)基中溶解氧的含量應(yīng)低于一個(gè)臨界值(／L)，否則將有利于生根，而不利于成胚。如果加入ATP，則有可能取代對(duì)低水平溶解氧的需要。酵母提取物在培養(yǎng)基中加入酵母提取物能提高胡蘿卜細(xì)胞胚胎發(fā)生的頻率。而且胚性細(xì)胞發(fā)育時(shí)還必須及時(shí)降低或去掉2，4一D。(2) 細(xì)胞分裂素類：許多植物體胚發(fā)生的誘導(dǎo)必須加入外源生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，CTK在裸子植物中起著比生長(zhǎng)素更重要的作用。保持秈稻愈傷組織的胚性結(jié)構(gòu)，并使其綠苗分化率明顯提高。 外源多胺或其前體可使人參體胚發(fā)生數(shù)增加4倍；外源Put使茄子體胚發(fā)生數(shù)增加6倍，并伴隨內(nèi)源Put增加，而抑制多胺合成和降解則使體胚發(fā)生數(shù)減少。 六、體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的生理生化變化 ATP酶活性提高，且早期的胚性細(xì)胞中ATP酶反應(yīng)產(chǎn)物主要沉積于質(zhì)膜和液泡膜上，后期ATP酶活性轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)、液泡和細(xì)胞核中。在大麥中POD、酯酶和酸性磷酸酶同工酶的結(jié)合應(yīng)用可以作為SE發(fā)生的標(biāo)志酶。胚性愈傷組織中都存在45KD至55KD的胚胎發(fā)生特異性蛋白質(zhì)的合成。隨著體細(xì)胞胚發(fā)育的進(jìn)程，DNA合成量明顯增加，至球形胚時(shí)DNA的合成量達(dá)到峰值。低水平乙烯有利于胚性能力的啟動(dòng)或表達(dá)，高水平乙烯抑制體胚發(fā)生。在皇冠草體細(xì)胞胚胎發(fā)生中，GA3的變化趨勢(shì)和細(xì)胞分裂素基本相同。指將植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的體細(xì)胞胚或能發(fā)育成完整植株的分生組織（芽、愈傷組織等）包埋在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和具有保護(hù)功能的外殼內(nèi)形成的在適宜條件下能夠發(fā)芽出苗的顆粒體。 Kitto等用聚氯乙烯包裹胡蘿卜胚狀體于1981年首次制成了人工種子。我國(guó)將其列入國(guó)家863計(jì)劃。 （一）研制人工種子的意義 快速繁殖遺傳工程植物、自交不親合植物、稀有珍貴物種或遠(yuǎn)緣雜種等； 在人工種子的制作過程中還可加人多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、有益微生物、農(nóng)藥、除草劑等以提高品種的抗逆境能力；人工種子還具有節(jié)約種源、不占用土地，一年四季均可工廠化生產(chǎn)的特點(diǎn) 。用這類材料包埋的人工種子變異小、萌發(fā)率和成苗率高。（三）人工種子的包埋 Redenhaugh于1984年首次篩選出透水性好的海藻酸鈉作為胚狀體和不定芽的包埋劑。當(dāng)體細(xì)胞胚與藻酸鈉混合以后，再滴入到硝酸鈣或氯化鈣溶液(100 mmol／L)中，30 min內(nèi)表面即可完全絡(luò)合，形成一層持久的種皮()。 第九章 植 物 脫 毒 技 術(shù)脫毒的重要性 有許多優(yōu)良的傳統(tǒng)品種，由于長(zhǎng)期栽培，尤其是保護(hù)地栽培面積不斷擴(kuò)大，植物周年生長(zhǎng)，寄主與病原媒介密度增加，導(dǎo)致病害日益嚴(yán)重。 病毒的侵染，抑制植株生長(zhǎng)，使形態(tài)畸變，產(chǎn)生皺縮、花葉、雜斑、條斑等多種癥狀，產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣。受病毒侵染的植株，可經(jīng)無性繁殖器官傳至下一代。 植物脫毒技術(shù)的歷史 第一株植物脫毒苗是1952年由法國(guó)人Morel等經(jīng)過大麗花莖尖組織培養(yǎng)獲得的。20世紀(jì)70年代，幾乎所有生產(chǎn)馬鈴薯的國(guó)家都在生產(chǎn)中使用這一技術(shù)。是植物病毒從感病寄主體通過機(jī)械摩擦造成的微傷(稱機(jī)械汁液傳染)，或通過感病和無病寄主體細(xì)胞間的有機(jī)結(jié)合傳染的，如帶病的鱗莖、塊莖、塊根、插條、嫁接苗、種子和花粉等。機(jī)械摩擦主要指田間病健株間的相互摩擦，或人為的接觸摩擦。介體傳播主要是昆蟲，其次是線蟲、螨類和真菌。 目前，歐洲、美國(guó)、日本、韓國(guó)是世界主要的蝴蝶蘭消費(fèi)市場(chǎng)。全球蝴蝶蘭種苗的大幅度增長(zhǎng)主要得益于以荷蘭為代表的歐洲市場(chǎng)和美國(guó)市場(chǎng)的強(qiáng)勁需求。2007年預(yù)計(jì)需求在1億株；在美國(guó)蝴蝶蘭已全年消費(fèi)額接近2億美元。國(guó)內(nèi)消費(fèi)的蝴蝶蘭不到2000萬株，相對(duì)于廣闊的市場(chǎng)與人口基數(shù)，國(guó)內(nèi)蝴蝶蘭市場(chǎng)還有很大的拓展空間?！‰S著世界蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)向中國(guó)轉(zhuǎn)移，中國(guó)將成為全球蝴蝶蘭的第一大生產(chǎn)基地。 病毒病問題日趨嚴(yán)重 世界范圍內(nèi)已報(bào)道從各種栽培蘭科植物中分離出至少25種病毒。1900 年出版的蘭科植物圖譜上有類似齒蘭環(huán)斑病毒的癥狀。 據(jù)報(bào)道，目前國(guó)內(nèi)90％蝴蝶蘭種苗帶有以上兩種病毒，臺(tái)灣生產(chǎn)的種苗有70％帶毒，嚴(yán)重影響到種苗質(zhì)量。 鄭平等（1999）利用ELISA方法對(duì)426個(gè)熱帶蘭花品種檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了建蘭花葉病毒(CyMV)％，齒舌蘭屬環(huán)斑病毒(ORSV) ％，其中蝴蝶蘭、卡特利亞蘭、文心蘭兩種病毒感病率均較高，石斛蘭感病率較低，對(duì)兩種病毒具較強(qiáng)的抗性；大花蕙蘭易感ORSV，