【正文】 將適當(dāng)濃度的病毒懸液接種到生長(zhǎng)單層細(xì)胞的玻璃平皿或扁瓶中，當(dāng)病毒吸附于細(xì)胞上后，再在其上復(fù)蓋一層溶化的半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂層，待凝固后，孵育培養(yǎng)。當(dāng)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖后，每一個(gè)感染性病毒顆粒在單層細(xì)胞中產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染細(xì)胞病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，若用中性紅等活性染料著色，在紅色的的背景中顯出沒(méi)有著色的“空斑”，清楚可見(jiàn)。由于每個(gè)空斑由單個(gè)病毒顆粒復(fù)制形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位（PFU）來(lái)表示。（2）50%致死量（LD50）或50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）的測(cè)定 本法可估計(jì)所含病毒的感染量。方法是測(cè)定病毒感染雞胚，易感動(dòng)物或組織培養(yǎng)后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋，接種于上述雞胚，易感動(dòng)物或組織培養(yǎng)中，經(jīng)一定時(shí)間后，觀察細(xì)胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動(dòng)物發(fā)病而死亡等，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出50%感染量或50%組織細(xì)胞感染量，可獲得比較準(zhǔn)確的病毒感染性滴度。3．病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察 病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負(fù)染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組織構(gòu)、序列同源性比較加以鑒定。4．血清學(xué)鑒定 用已知的診斷血清來(lái)鑒定。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可鑒定病毒科屬；中和試驗(yàn)或血凝搗蛋制試驗(yàn)可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀，檢材來(lái)源及流行季節(jié)等加以綜合分析，并應(yīng)注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，須用病人急性期與恢復(fù)期雙份血清作血清學(xué)試驗(yàn)，血清抗體滴度有≥4倍以上增高，才有意義。三、病毒核酸及抗原的直接檢出（一）直接檢出病毒核酸1．核酸雜交（Nucleic acid hybridization） 臨床病毒學(xué)中報(bào)速診斷方法通常是檢測(cè)標(biāo)本中的病毒抗原，然而核酸分子雜交具有高度敏感性和特異性，斑點(diǎn)雜交 (Dot hybridization) 廣泛用于檢測(cè)呼吸道標(biāo)本，尿標(biāo)本中的病毒核酸。標(biāo)本滴加到硝酸纖維素膜上，病毒DNA結(jié)合到膜上，在原位進(jìn)行鹼變性處理后，有放射標(biāo)記的已知病毒DNA片段雜并，兩條單股核酸按鹼基到補(bǔ)原則結(jié)合成雙股，經(jīng)放射自顯影，陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)斑點(diǎn)狀雜交信號(hào)。含輪狀病毒的糞便標(biāo)本經(jīng)熱變性處理，點(diǎn)到膜上，使用輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄的放射標(biāo)記探針做斑點(diǎn)雜交，敏感性高于ELISA。腸道病毒也可用互補(bǔ)的DNA探針做斑點(diǎn)雜交。目前核酸分子雜交不但用來(lái)檢測(cè)急性病人標(biāo)本中的病毒DNA，也用于檢測(cè)不易分離培養(yǎng)的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標(biāo)本中的病毒DNA。2．多聚酶鏈反應(yīng) (Polymerase chain reaction, PCR) 一種體外基因擴(kuò)增法。先將待檢標(biāo)本DNA熱變性為單股DNA做為模板，加一對(duì)人工合成的與模板DNA兩端各20個(gè)鹼基互補(bǔ)的引物，在耐熱DNA多聚酶作用下，使四種脫氧核苷按模板3ˊ端引物向5ˊ端延伸DNA鏈，經(jīng)20～40個(gè)循環(huán)，可使1個(gè)拷貝的核酸擴(kuò)增至106以上，經(jīng)瓊脂糖電泳，可見(jiàn)到溴化乙錠染色的核酸條帶，擴(kuò)增片段的大小取決于兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷，尤其適用于不易分離培養(yǎng)及含量極少的病毒標(biāo)本，有較大應(yīng)用前景。（二）直接檢測(cè)病毒抗原1．免疫熒光（IF）技術(shù) 如前所述IF可用于細(xì)胞培養(yǎng)病毒的鑒定，也適用檢測(cè)臨床標(biāo)本中病毒抗原，具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)。直接免疫熒光技術(shù)是用熒光素直接標(biāo)記特異性抗體，檢測(cè)病毒抗原；間接免疫熒光技術(shù)是先用特異性抗體與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的抗體與特異性抗體結(jié)合，從而間接識(shí)別抗原。可取咽喉脫落細(xì)胞，檢測(cè)呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原；取病灶刮片或腦活檢標(biāo)本，檢測(cè)單純皰疹病毒抗原；取尿沉渣檢測(cè)巨細(xì)胞病毒抗原等。近年來(lái)使用單克隆抗體大大提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。2．免疫酶法（IEA） 原理與應(yīng)用范圍同免疫熒光技術(shù)，IEA是用酶（通常是過(guò)氧化物酶）取代熒光素標(biāo)記抗體，酶催化底物形成有色產(chǎn)物，在普通光學(xué)顯微鏡下清晰可見(jiàn)，不需熒光顯微鏡，便于推廣使用。3．放射免疫測(cè)定法（RIA） 有競(jìng)爭(zhēng)RIA和因相RNA二種方法。競(jìng)急RIA是同位素標(biāo)記的已知抗原與標(biāo)本中未標(biāo)記的待檢抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特異性抗體的試驗(yàn)，將形成的復(fù)合物分離出來(lái)，用放射免疫檢測(cè)儀測(cè)定放射活性，同時(shí)與系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，確定出待檢抗原的濃度。因相RIA是用特異性抗體包被因相以捕獲標(biāo)本中的抗原，然后加入放射性標(biāo)記的特異性抗體與抗原結(jié)合，測(cè)定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于測(cè)定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。4．酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 先將特異性抗體包被（吸附）到塑料微培板孔中以捕捉標(biāo)本中相應(yīng)抗原，然后加入酶標(biāo)特異性抗體，相應(yīng)抗原被夾在抗體之間，當(dāng)加入酶的底物后顯色，顯色程度直接反映了標(biāo)本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接觸放射性物質(zhì)，已被多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用。此外，對(duì)難以分離培養(yǎng)，形態(tài)特殊且病毒數(shù)量較多的標(biāo)本，可用電鏡或免疫電鏡法直接觀察，是一種快速診斷與鑒定病毒的方法，如輪狀病毒、乙肝病毒。四、特異性抗體的檢測(cè)特異性抗體的檢測(cè)病毒感染后通常誘發(fā)針對(duì)病毒一種或多種抗原免疫應(yīng)答，特異性抗體效價(jià)升高或lgM抗體出現(xiàn)有輔助臨床診斷的價(jià)值。（一）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF） CF分二個(gè)階段：（一個(gè)為已知，一個(gè)為待檢）混合，加入定量補(bǔ)體，若抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，則補(bǔ)體被消耗；，若補(bǔ)本已與抗原抗體復(fù)合物完全結(jié)合，沒(méi)有剩補(bǔ)體存在，那么綿羊紅細(xì)胞不會(huì)溶血，結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明待檢標(biāo)本中有特異性存在，出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)血清標(biāo)本最高稀釋度為抗體的效價(jià)。反之為陰性結(jié)果。由于補(bǔ)體結(jié)合抗體產(chǎn)生早，消失快，適于診斷病毒近期感染。（表235）。取血時(shí)期 血清稀釋倍數(shù)及試驗(yàn)結(jié)果 抗體效價(jià) 1：21：41：81：161：321：641：128發(fā)病2～3內(nèi)血清發(fā)病2～3周后血清 +　+ ++ ++++1：8 1：32* *此例的抗體效價(jià)升高4倍，有診斷意義。（二）中和試驗(yàn)（NT） 在活體或活細(xì)胞內(nèi)測(cè)定病毒被特異性抗體中和、而失去致病力的試驗(yàn)。試驗(yàn)時(shí)：①須先測(cè)出病毒的半數(shù)致死量（LD50）或半數(shù)感染量（ID50）；②隨即取活病毒與被試血清按不同比例混合，放置1～2小時(shí)讓其充分中和；③將病毒與血清混合液注入各組動(dòng)物、雞胚或組織細(xì)胞培養(yǎng)管內(nèi)培養(yǎng)；④根據(jù)動(dòng)物、雞胚死亡數(shù)或細(xì)胞病變的管數(shù)，計(jì)算出百分比（%），然后再計(jì)算這些試驗(yàn)對(duì)象中的半數(shù)免于死亡或免于致病所需要的最少量血清（或最大量的病毒），就是該血清的中和抗體效價(jià)（稱為50%終點(diǎn)的中和效價(jià)）。診斷病毒性疾病時(shí)，須取病人雙份血清同時(shí)做對(duì)比試驗(yàn)，病后血清的中和抗體效價(jià)也必須超過(guò)病初血清4倍以上，才能確診（表236）。用此法鑒定病毒時(shí)，須將病毒分別與免疫血清及血清正常血清（對(duì)照）混合做對(duì)比試驗(yàn)，免疫血清比正常血清多中和50～100倍劑量的病毒，才能斷定是該病毒。病毒中和抗體的特異性高，持續(xù)時(shí)間久，以往受顯性或隱性感染后，血中可長(zhǎng)期存在中和抗體，所以適用于流行病學(xué)調(diào)查或人群免疫水平研究，但因試驗(yàn)方法繁雜，耗用動(dòng)物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)較多，故一般不作常規(guī)使用。（三）血凝抑制試驗(yàn)（Hemagglutination inhibition test,HIT）某些病毒（流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、腦炎病毒等）能凝集紅細(xì)胞，而抗體與這些病毒結(jié)合后卻能阻止它們的凝集，若雙份血清有≥4倍以上滴度增高，也可用于診斷這類病毒感染。本法簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、特異性高，常用于流行病學(xué)調(diào)查等。（四）lgM捕捉ELISA 特異性lgM出現(xiàn)于病毒感染的早期或病毒感染的活動(dòng)期，因此可從急性期病人單份血清中檢出特異性lgM，這是病毒感染實(shí)驗(yàn)室早期診斷的可靠方法。實(shí)驗(yàn)中先用u鏈血清包被微培板孔，用以捕捉血清標(biāo)本中的lgM類抗體，再加入特異性病毒抗原及酶標(biāo)抗體以證實(shí)特異性lgM的存在?，F(xiàn)已廣泛用于病毒病的早期診斷。在先天性感染中，lgM檢測(cè)有特殊意義，因lgM不能通過(guò)胎盤(pán)，新生兒血清中發(fā)現(xiàn)抗病毒lgM提示為宮內(nèi)感染。第二節(jié) 病毒感染的防治原則一、免疫預(yù)防 （一）人工自動(dòng)免疫 1．減毒活病毒疫苗（Live attenuated virus vaccines） 選用抗原性與野毒株一致而穩(wěn)定無(wú)毒或顯著減毒的活病毒突變株做為疫苗?？珊Y選自然減毒株，或在多種宿主中連續(xù)傳代培養(yǎng)誘導(dǎo)出減毒株。接種活病毒疫苗近似自然感染，在宿主中可繁殖，僅接種一次便可較長(zhǎng)時(shí)間刺激抗體產(chǎn)生及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并可產(chǎn)生局部抗體。目前推薦使用的減毒活病毒疫苗見(jiàn)表237。表237 預(yù)防人類病毒性疾病的疫苗疾病疫苗來(lái)源病毒狀態(tài)使用方法脊髓炎質(zhì)炎麻疹腮腺炎風(fēng)疹乙型肝炎乙型腦炎狂犬病 人二倍體細(xì)胞系雞胚細(xì)胞培養(yǎng)雞胚細(xì)胞培養(yǎng)鴨胚或人二倍體細(xì)胞血源純化HBsAg、酵母表達(dá)重組HBsAg地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)地鼠腎或人二倍體細(xì)胞 減毒活病毒株減毒活病毒株減毒活病毒株減毒活病毒株病毒亞單位滅活病毒滅活病毒 口服皮下接種皮下接種皮下接種皮下接種皮下接種皮下接種 活疫苗的不利之處在于：①在接種者體內(nèi)增殖中有恢復(fù)毒力的潛在危險(xiǎn)性；②野毒株感染可干擾疫苗株的免疫效果；③老年人、免疫缺陷者不宜接種；④保存期、有效期有限。目前研究通過(guò)基因工程手段構(gòu)建減毒活疫苗，如使用無(wú)毒的牛痘苗病毒作載體，將期望表達(dá)的外源基因插入，構(gòu)建成重組痘苗病毒，發(fā)展為安全有效的多價(jià)減毒活毒疫苗?，F(xiàn)已構(gòu)建出表達(dá)HBSAg、HSVgD、HIVgp120等重組痘苗病毒，動(dòng)物試驗(yàn)安全有效。2．滅活病毒疫苗(Killed virus vaccines) 將純化的病毒用甲醛處理滅活其感染性，而不損傷病毒結(jié)構(gòu)蛋白，做為一種疫苗。滅活病毒疫苗是完整的病毒，可誘生循環(huán)抗體，獲得一定程度的免疫力。應(yīng)注意的是：①制備中確保無(wú)殘留的活病毒；②加強(qiáng)免疫或后續(xù)病毒感染時(shí)可能出現(xiàn)對(duì)外源性蛋白質(zhì)的超敏反應(yīng)；③對(duì)呼吸道、消化道感染的病毒病預(yù)防效果不佳，不能產(chǎn)生足夠的局部免疫力；④細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答較差。3．亞單位疫苗(Subunit vaccines) 用化學(xué)試劑裂解病毒，提取囊膜或衣殼的蛋白質(zhì)亞單位，除去核酸而制成亞單位疫苗。目前用基因克隆到原核或真核表達(dá)載體中，并在原核或真核細(xì)胞中得到表達(dá)，經(jīng)純化制備出亞單位疫苗。在酵母菌中表達(dá)的HBSAg已投放市場(chǎng)。（二）人工被動(dòng)免疫 常用免疫制劑有高效價(jià)免疫血清、病人恢復(fù)期血清、胎盤(pán)（兩種）球蛋白及細(xì)胞免疫有關(guān)的轉(zhuǎn)移因子等。常用于甲肝、麻疹及脊液灰質(zhì)炎的緊急預(yù)防，可使病情減輕或不出現(xiàn)癥狀。二、藥物治療 （一）化學(xué)療劑 病毒性疾病目前尚缺少特效治療藥物，原因是病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖，凡能殺死病毒的藥物，同時(shí)多對(duì)宿主細(xì)胞也有損害。隨著分子病毒學(xué)研究的進(jìn)展，目前能對(duì)藥物抑制作用的確切靶位作出鑒定。理論上，病毒復(fù)制的任何環(huán)節(jié)均是抗病毒治療的作用靶位。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些藥物有治療價(jià)值，允許使用的有無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷，金剛胺、碘苷、三氟尿苷、腺苷、病毒唑、疊氮胸苷等，使用范圍有一定局限性，且或多或少有細(xì)胞毒性作用。1．核苷類似物無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷（Acycloguanosine, Acyclovir） 為脫氧鳥(niǎo)苷的類似物，該藥被病毒編碼的胸苷激酶（TK）磷酸化，借助病毒DNA多聚酶，摻入病毒DNA中，阻斷DNA鏈的延伸。對(duì)編碼TK的單純皰疹，水痘帶狀皰疹病毒感染有治療作用，而對(duì)不編碼TK的巨細(xì)胞病毒、EB病毒不敏感。磷酸化的無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷對(duì)宿主細(xì)胞DNA多聚酶親和力較低，較少影響宿主細(xì)胞。已用于治療原發(fā)性皰疹性角膜炎，但對(duì)復(fù)發(fā)性皰疹損傷治療效不佳；全身用藥可預(yù)防潛伏感染的復(fù)燃，對(duì)處于免疫抑制狀態(tài)病人的活動(dòng)性皰疹感染也有治療作用。此外，與無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷類似的甲基鳥(niǎo)嘌呤衍生物丙氧鳥(niǎo)苷 (Ganciclovir ,dihydroxypropoxymethyl guanine, DHPG) ，體外實(shí)驗(yàn)表明對(duì)巨細(xì)胞病毒有明顯抑制作用，在巨細(xì)胞病毒嚴(yán)重感染的病人取得了較好的效果，機(jī)理不詳。疊氮胸苷 (Azidodeoxythymidine, AZT) 為合成胸腺嘧啶核苷的類似物，阻斷前病毒DNA合成，從而抑HIV的復(fù)制。HIV逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)該藥的敏感性較細(xì)胞DNA多聚酶高100倍，對(duì)AIDS病人有治療作用，但該藥有較多毒付作用，包括骨髓抑制，停藥后可恢復(fù)。阿糖腺苷 (Adenine arabinoside, araA) 為腺嘌呤的衍生物，作用機(jī)理不詳，可能是抑制病毒多聚酶，阻斷病毒DNA合成對(duì)細(xì)胞的毒性較阿糖胞苷小。用于單純皰疹性角膜炎的局部治療，靜脈給藥對(duì)單純皰疹和水痘帶狀皰疹感染療效明顯，皰疹性腦炎如能早期診斷早期使用araA 效果明顯。主要副作用為惡心、嘔吐、血像不正常、靜脈炎。允許在體內(nèi)使用是因?yàn)樵谥委焺┝亢投拘詣┝恐g存在一個(gè)相當(dāng)寬的范圍。每日每公斤體重 10mg araA靜脈滴注，未發(fā)生嚴(yán)重的毒性和免疫抑制作用。碘苷 (Iododeoxyuridine,IDU ) 又稱皰疹凈， 為尿嘧啶的類似物，抑制皰疹病毒TK并可摻入病毒DNA中，同時(shí)也影響宿主細(xì)胞DNA合成。臨床上用于HSV角膜損傷的局部治療，是最早使用的抗病毒藥物。三氟尿苷 (Trifluridine) 作用機(jī)理同磺苷。局部用藥治療皰疹性角膜炎，對(duì)耐碘苷的皰疹病毒株有效。病毒唑 (Ribovirin virozole) 又稱三氮唑核苷，結(jié)構(gòu)與鳥(niǎo)苷類似，是一種強(qiáng)的單磷酸次黃嘌呤核苷脫氫酶抑制劑，通過(guò)抑制該酶活性，阻礙病毒核酸的合成。體外試驗(yàn)表明對(duì)多種DNA和RNA病毒有抑制作用。小顆粒氣溶膠施放裝置用于治療流感，也允許以氣溶膠形式治療嬰兒呼吸道合胞病毒感染。靜脈用藥已證明對(duì)拉沙病毒感染有效。主要副作用是貧血，停藥后可恢復(fù)。2．其他類型抗病毒藥物金剛胺（Amantadine） 一種合成胺，阻斷甲型流感病毒吸附或脫殼。預(yù)防性用藥后有明顯保護(hù)作用，但對(duì)乙型流感及其他病毒無(wú)效。金剛乙胺(Rimantadine)為金剛胺的衍生