【正文】 預(yù)防性用藥后有明顯保護(hù)作用，但對乙型流感及其他病毒無效。主要副作用是貧血，停藥后可恢復(fù)。小顆粒氣溶膠施放裝置用于治療流感，也允許以氣溶膠形式治療嬰兒呼吸道合胞病毒感染。病毒唑 (Ribovirin virozole) 又稱三氮唑核苷，結(jié)構(gòu)與鳥苷類似，是一種強(qiáng)的單磷酸次黃嘌呤核苷脫氫酶抑制劑，通過抑制該酶活性，阻礙病毒核酸的合成。三氟尿苷 (Trifluridine) 作用機(jī)理同磺苷。碘苷 (Iododeoxyuridine,IDU ) 又稱皰疹凈， 為尿嘧啶的類似物，抑制皰疹病毒TK并可摻入病毒DNA中，同時(shí)也影響宿主細(xì)胞DNA合成。允許在體內(nèi)使用是因?yàn)樵谥委焺┝亢投拘詣┝恐g存在一個(gè)相當(dāng)寬的范圍。用于單純皰疹性角膜炎的局部治療，靜脈給藥對單純皰疹和水痘帶狀皰疹感染療效明顯，皰疹性腦炎如能早期診斷早期使用araA 效果明顯。HIV逆轉(zhuǎn)錄酶對該藥的敏感性較細(xì)胞DNA多聚酶高100倍，對AIDS病人有治療作用，但該藥有較多毒付作用，包括骨髓抑制，停藥后可恢復(fù)。此外，與無環(huán)鳥苷類似的甲基鳥嘌呤衍生物丙氧鳥苷 (Ganciclovir ,dihydroxypropoxymethyl guanine, DHPG) ，體外實(shí)驗(yàn)表明對巨細(xì)胞病毒有明顯抑制作用，在巨細(xì)胞病毒嚴(yán)重感染的病人取得了較好的效果，機(jī)理不詳。磷酸化的無環(huán)鳥苷對宿主細(xì)胞DNA多聚酶親和力較低，較少影響宿主細(xì)胞。1．核苷類似物無環(huán)鳥苷（Acycloguanosine, Acyclovir） 為脫氧鳥苷的類似物，該藥被病毒編碼的胸苷激酶（TK）磷酸化，借助病毒DNA多聚酶，摻入病毒DNA中，阻斷DNA鏈的延伸。理論上，病毒復(fù)制的任何環(huán)節(jié)均是抗病毒治療的作用靶位。二、藥物治療 （一）化學(xué)療劑 病毒性疾病目前尚缺少特效治療藥物，原因是病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖，凡能殺死病毒的藥物，同時(shí)多對宿主細(xì)胞也有損害。（二）人工被動免疫 常用免疫制劑有高效價(jià)免疫血清、病人恢復(fù)期血清、胎盤（兩種）球蛋白及細(xì)胞免疫有關(guān)的轉(zhuǎn)移因子等。目前用基因克隆到原核或真核表達(dá)載體中，并在原核或真核細(xì)胞中得到表達(dá)，經(jīng)純化制備出亞單位疫苗。應(yīng)注意的是：①制備中確保無殘留的活病毒；②加強(qiáng)免疫或后續(xù)病毒感染時(shí)可能出現(xiàn)對外源性蛋白質(zhì)的超敏反應(yīng)；③對呼吸道、消化道感染的病毒病預(yù)防效果不佳，不能產(chǎn)生足夠的局部免疫力；④細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答較差。2．滅活病毒疫苗(Killed virus vaccines) 將純化的病毒用甲醛處理滅活其感染性，而不損傷病毒結(jié)構(gòu)蛋白，做為一種疫苗。目前研究通過基因工程手段構(gòu)建減毒活疫苗，如使用無毒的牛痘苗病毒作載體，將期望表達(dá)的外源基因插入，構(gòu)建成重組痘苗病毒，發(fā)展為安全有效的多價(jià)減毒活毒疫苗。目前推薦使用的減毒活病毒疫苗見表237?？珊Y選自然減毒株，或在多種宿主中連續(xù)傳代培養(yǎng)誘導(dǎo)出減毒株。在先天性感染中，lgM檢測有特殊意義，因lgM不能通過胎盤，新生兒血清中發(fā)現(xiàn)抗病毒lgM提示為宮內(nèi)感染。實(shí)驗(yàn)中先用u鏈血清包被微培板孔，用以捕捉血清標(biāo)本中的lgM類抗體，再加入特異性病毒抗原及酶標(biāo)抗體以證實(shí)特異性lgM的存在。本法簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、特異性高，常用于流行病學(xué)調(diào)查等。病毒中和抗體的特異性高，持續(xù)時(shí)間久，以往受顯性或隱性感染后，血中可長期存在中和抗體，所以適用于流行病學(xué)調(diào)查或人群免疫水平研究，但因試驗(yàn)方法繁雜，耗用動物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)較多，故一般不作常規(guī)使用。診斷病毒性疾病時(shí)，須取病人雙份血清同時(shí)做對比試驗(yàn)，病后血清的中和抗體效價(jià)也必須超過病初血清4倍以上，才能確診（表236）。（二）中和試驗(yàn)（NT） 在活體或活細(xì)胞內(nèi)測定病毒被特異性抗體中和、而失去致病力的試驗(yàn)。（表235）。反之為陰性結(jié)果。四、特異性抗體的檢測特異性抗體的檢測病毒感染后通常誘發(fā)針對病毒一種或多種抗原免疫應(yīng)答，特異性抗體效價(jià)升高或lgM抗體出現(xiàn)有輔助臨床診斷的價(jià)值。因其敏感性接近RIA，又不接觸放射性物質(zhì)，已被多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用。RIA是最敏感的方法，已用于測定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。競急RIA是同位素標(biāo)記的已知抗原與標(biāo)本中未標(biāo)記的待檢抗原競爭性結(jié)合特異性抗體的試驗(yàn)，將形成的復(fù)合物分離出來，用放射免疫檢測儀測定放射活性，同時(shí)與系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原測定結(jié)果進(jìn)行比較，確定出待檢抗原的濃度。2．免疫酶法（IEA） 原理與應(yīng)用范圍同免疫熒光技術(shù)，IEA是用酶（通常是過氧化物酶）取代熒光素標(biāo)記抗體，酶催化底物形成有色產(chǎn)物，在普通光學(xué)顯微鏡下清晰可見，不需熒光顯微鏡，便于推廣使用?？扇⊙屎砻撀浼?xì)胞，檢測呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原；取病灶刮片或腦活檢標(biāo)本，檢測單純皰疹病毒抗原；取尿沉渣檢測巨細(xì)胞病毒抗原等。（二）直接檢測病毒抗原1．免疫熒光（IF）技術(shù) 如前所述IF可用于細(xì)胞培養(yǎng)病毒的鑒定，也適用檢測臨床標(biāo)本中病毒抗原，具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)。先將待檢標(biāo)本DNA熱變性為單股DNA做為模板，加一對人工合成的與模板DNA兩端各20個(gè)鹼基互補(bǔ)的引物，在耐熱DNA多聚酶作用下，使四種脫氧核苷按模板3ˊ端引物向5ˊ端延伸DNA鏈，經(jīng)20～40個(gè)循環(huán)，可使1個(gè)拷貝的核酸擴(kuò)增至106以上，經(jīng)瓊脂糖電泳，可見到溴化乙錠染色的核酸條帶，擴(kuò)增片段的大小取決于兩引物的間距。目前核酸分子雜交不但用來檢測急性病人標(biāo)本中的病毒DNA，也用于檢測不易分離培養(yǎng)的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標(biāo)本中的病毒DNA。含輪狀病毒的糞便標(biāo)本經(jīng)熱變性處理，點(diǎn)到膜上，使用輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄的放射標(biāo)記探針做斑點(diǎn)雜交，敏感性高于ELISA。三、病毒核酸及抗原的直接檢出（一）直接檢出病毒核酸1．核酸雜交（Nucleic acid hybridization） 臨床病毒學(xué)中報(bào)速診斷方法通常是檢測標(biāo)本中的病毒抗原，然而核酸分子雜交具有高度敏感性和特異性，斑點(diǎn)雜交 (Dot hybridization) 廣泛用于檢測呼吸道標(biāo)本，尿標(biāo)本中的病毒核酸。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可鑒定病毒科屬；中和試驗(yàn)或血凝搗蛋制試驗(yàn)可鑒定病毒種、型及亞型。還可用分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組織構(gòu)、序列同源性比較加以鑒定。方法是測定病毒感染雞胚，易感動物或組織培養(yǎng)后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋，接種于上述雞胚，易感動物或組織培養(yǎng)中，經(jīng)一定時(shí)間后，觀察細(xì)胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動物發(fā)病而死亡等，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出50%感染量或50%組織細(xì)胞感染量，可獲得比較準(zhǔn)確的病毒感染性滴度。由于每個(gè)空斑由單個(gè)病毒顆粒復(fù)制形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位（PFU）來表示。將適當(dāng)濃度的病毒懸液接種到生長單層細(xì)胞的玻璃平皿或扁瓶中，當(dāng)病毒吸附于細(xì)胞上后，再在其上復(fù)蓋一層溶化的半固體營養(yǎng)瓊脂層，待凝固后，孵育培養(yǎng)。前者為不產(chǎn)生CPE的病毒（如風(fēng)疹病毒）但能干擾以后進(jìn)入的病毒（如ECHO病毒）增殖，使后者進(jìn)入宿主細(xì)胞不再生產(chǎn)CPE。這一現(xiàn)象不僅可作為這類病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。表234 病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征病毒增殖指征CPE病毒小RNA病毒單純皰疹病毒腺病毒副粘病毒HIV非CPE病毒正粘病毒副粘病毒風(fēng)疹病毒鼻病毒細(xì)胞園縮、單層破壞細(xì)胞腫大變園細(xì)胞變園堆積成葡萄狀多核巨細(xì)胞（合胞體）紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象干擾并阻止其他病毒（如ECHO病毒）的細(xì)胞致病作用（2）紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象（Hemadsorption phenomenon） 流感病毒和某些副粘病毒感染細(xì)胞后2448小時(shí)，以細(xì)胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動物及人的紅細(xì)胞，發(fā)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE，普通光學(xué)倒置顯微鏡下可觀察上述細(xì)胞病變，結(jié)合臨床表現(xiàn)可做出預(yù)測性診斷（表234）。根據(jù)病毒的特性可分別接種在雞胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內(nèi)或靜脈內(nèi)，如有病毒增殖，則雞胚發(fā)生異常變化或羊水、尿囊液出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分離培養(yǎng)；但很多病毒在雞胚中不生長。接種后逐日觀察實(shí)驗(yàn)動物發(fā)病情況，如有死亡，則取病變組織剪碎，研磨均勻，制成懸液，繼續(xù)傳代，并作鑒定。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。T淋巴細(xì)胞在加入T細(xì)胞生長因子（IL2）后可在體外培養(yǎng)，為研究人類逆轉(zhuǎn)錄病毒（HIV、HTLV）提供了條件，HIV在T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖形成多核巨細(xì)胞。表233 病毒增殖用部分細(xì)胞系及來源細(xì)胞系名稱 二倍體細(xì)胞系來源 HDCSMRC9WI38傳代細(xì)胞系HelaHep2VeroBHK 人胚肺細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞人上皮細(xì)胞猴腎細(xì)胞地鼠腎細(xì)胞 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（Lymphocyte culture） 正常成熟的淋巴細(xì)胞不經(jīng)特殊處理不能在體外傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞培養(yǎng) (Continous cell culture) 通常是由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而來（如 Hela 、Hep Vero細(xì)胞系等），染色體數(shù)為非整倍體，細(xì)胞生長迅速，可無限傳代，在液氮中能長期保存。二倍體細(xì)胞一經(jīng)建立，應(yīng)盡早將細(xì)胞懸浮于10%二甲基亞砜中，大量分裝安瓿貯存于液氮（196℃ ）內(nèi)，做為“種子”，供以后傳代用。二倍體細(xì)胞培養(yǎng)(Diploid cell cultune) 原代細(xì)胞只能傳23代細(xì)胞就退化，在多數(shù)細(xì)胞退化時(shí)，少數(shù)細(xì)胞能繼續(xù)傳下來，且保持染色體數(shù)為二倍體，稱為二倍體細(xì)胞。原代細(xì)胞均為二倍體細(xì)胞，可用于產(chǎn)生病毒疫苗，如兔腎細(xì)胞生產(chǎn)風(fēng)疹疫苗，雞成纖維細(xì)胞產(chǎn)生麻疹疫苗，猴腎細(xì)胞生產(chǎn)脊液灰質(zhì)炎疫苗。細(xì)胞培養(yǎng)適于絕大多數(shù)病毒生長，是病毒實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)。1．細(xì)胞培養(yǎng) 用分散的活細(xì)胞培養(yǎng)稱細(xì)胞培養(yǎng)（Cell culture）。無菌性腦炎患者也可取腦脊液檢測特異性lgM。檢測特異性抗體需要采取急性期與恢復(fù)期雙份血清，第一份盡可能在發(fā)病后立即采取，第二份在發(fā)病后2～3周采取。病變組織則應(yīng)保存于50%的甘油緩沖鹽水中。（三）冷藏速送病毒離活體后在室溫下很易死亡，故采得檢材應(yīng)盡快送檢。供分離病毒、檢出核酸及抗原的標(biāo)本的，要求：（一）盡早采取在發(fā)病初期（急性期）采取，較易檢出病毒，越遲陽性率越低。臨床醫(yī)師根據(jù)流行病學(xué)資料，疾病的癥狀與體征綜合判斷可能為何種病毒感染，留取適宜的標(biāo)本送檢。了解有效的抗病毒藥物的抗病毒機(jī)制及應(yīng)用價(jià)值。第二十五章 病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷與防治原則[目的要求]熟悉病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。近年來在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，活化的T細(xì)胞釋放的LL2促使T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞在病毒感染的部位大量聚集，釋放IFNγ 、IFNα并形成足夠的濃度，從而在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯兩個(gè)水平上抑制病毒大分子的合成，并誘導(dǎo)鄰近正常細(xì)胞建立抗病毒狀態(tài)。病毒抗原大多為胸腺依賴性抗原，Th和Ts分別從正向和反向調(diào)節(jié)機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱程度，影響抗體介導(dǎo)的和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫保護(hù)或免疫損傷作用。它們的活化與殺傷功能受細(xì)胞表面相應(yīng)的MHCⅡ類抗原的限制。CTL殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制可能是釋放胰蛋白酶樣的絲氨酸蛋白酶和細(xì)胞毒性淋巴因子（如穿孔素Perfarin）等，導(dǎo)致靶細(xì)胞溶解。4．感染細(xì)胞表面表達(dá)的病毒抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，或通過ADCC作用或通過激活補(bǔ)體，使靶細(xì)胞溶解。2．病毒表面抗原（如流感病毒的血凝素和神經(jīng)氨酸酶）與相應(yīng)的抗體（中和抗體或非中和抗體）結(jié)合時(shí)，易被吞噬清除。（二）抗體介導(dǎo)的殺病毒作用方式1．中和抗體和病毒表面抗原結(jié)合，導(dǎo)致病毒表面蛋白質(zhì)構(gòu)型的改變，阻止其吸附于敏感細(xì)胞。不具有吸附穿入作用的病毒表面抗原及病毒顆粒內(nèi)部抗原所誘生的抗體，稱之為非中和抗體。粘膜表面分泌型lgA的出現(xiàn)比血流中l(wèi)gM稍晚，它是呼吸道和腸道抵抗病毒的重要因素。如抗流感病毒血凝素抗原的抗體，為中和抗體，具有免疫保護(hù)作用?；畈《九c中和抗體結(jié)合，導(dǎo)致病毒喪失感染力，稱為中和反應(yīng)。在病毒感染時(shí)，干擾素的產(chǎn)生較特異性抗體早，因此，對于阻止病毒病的發(fā)生及病毒病患者的康復(fù)可能起重要作用。干擾素在病毒學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)及分子遺傳學(xué)等領(lǐng)域，均有理論與實(shí)際意義。其中二種酶須經(jīng)雙股RNA及ATP激活，一為蛋白激酶，激活后可使合成蛋白質(zhì)的起動因子2（eIF2）同磷酸化而失活，抑制蛋白質(zhì)合成；另一種為2ˊ5ˊA合成酶，活化后催化合成2ˊ5ˊ寡腺苷酸，再激活潛在的核酸內(nèi)切酶，使病毒mRNA降解，抑制病毒蛋白合成。現(xiàn)已知Ⅰ型干擾素受體基因在人染色體G21長臂上，Ⅱ型干擾素受體基因位于第6對染色體上，這就決定了IFN具有一定的程屬特異性。因此誘生的干擾素很快釋放到細(xì)胞外，作用于鄰近的未受感染的細(xì)胞膜受體上，使細(xì)胞建立抗病毒狀態(tài)。干擾素的誘生在正常情況下，基因處于靜止?fàn)顟B(tài)，干擾素的產(chǎn)生受到抑制。干擾素的分類現(xiàn)知人的干擾素有3種：IFNα即白細(xì)胞干擾素，IFNβ即成纖維細(xì)胞干擾素，IFNγ即免疫干素（T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子）；前二種屬Ⅰ型，后一種屬Ⅱ型。 IFN是指在誘生劑和某些細(xì)胞因子的作用下，由細(xì)胞基因編碼產(chǎn)生的一組糖蛋白質(zhì)，具有高度抗病毒、抗腫瘤及多種免疫調(diào)節(jié)功能。相反，狂犬病毒可感染多種溫血動物。在人體中難以做出評價(jià)，但隨著免疫應(yīng)答基因的深入研究有助于闡明這一問題。（五）遺傳因素與種屬免疫動物實(shí)驗(yàn)證明遺傳因素影響病毒感染的抵抗力或敏感性。（四）年齡與生理狀態(tài)嬰兒有來自母體的lgG及母乳中的lgA，6個(gè)月內(nèi)較少病毒性感染；兒童脊髓灰質(zhì)炎病毒通常引起輕型或亞臨床型感染，然而在成年人則往往是麻痹型感染；老年人因免疫力下降，患帶狀皰疹較為嚴(yán)重。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL1及IFN引起機(jī)體發(fā)熱反應(yīng)，當(dāng)超過37℃時(shí)大多數(shù)病毒復(fù)制受到壓抑，因此發(fā)熱是一種保護(hù)性機(jī)制，使用藥物強(qiáng)制退熱將延長病毒感染的康復(fù)時(shí)間。此外，NK細(xì)胞尚具有抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）。（二）單核吞噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞單核吞噬細(xì)胞，尤其是固定或游走的巨噬細(xì)胞吞噬并消化大分子異物，抗體或補(bǔ)體的活性成分起調(diào)理吞噬作用；IFNr活化的巨噬細(xì)胞增強(qiáng)殺滅病毒的能力。本節(jié)中干擾素為重點(diǎn)。前者指獲得性免疫力產(chǎn)生之前，機(jī)體對病毒初次感染的天然抵抗力，主要為單核吞噬細(xì)胞、自然殺傷