【正文】 驗測定核轉錄因子ISGF3和GAF，并用實時熒光PCR方法對干擾素誘導的抗病毒蛋白MxA、PKR、OAS1等基礎表達量、病毒刺激后、干擾素誘導下等情況下的表達量進行定量。主要通過干擾素信號傳導途徑異常的分析，就宿主遺傳因素對干擾素治療抵抗的影響進行探討。5. 白色念珠菌耐藥機制研究（1）白色念珠菌耐藥性的分子流行病學研究1）建立我國白色念珠菌臨床菌種庫及其藥物敏感性數(shù)據(jù)庫，分析CYP5CDRMDRTACCAP1的表達差異，明確我國白色念珠菌耐藥性形成的分子特點。2）收集不少于50對白色念珠菌耐藥株及其親本株樣本，用PCR法高保真擴增出CYP5TACCAP1基因，測序并與GenBank中基因比對；分析上述基因變異與耐藥性分布和耐藥程度的關系，尋找靶酶基因和轉錄調控因子基因變異與選擇壓力的關系及常見的關鍵變異位點。（2）白色念珠菌耐藥相關新基因功能及耐藥性形成機制研究1）利用基因表達譜芯片雜交、蛋白質二維電泳技術，結合生物信息學分析，研究上述50對白色念珠菌耐藥株及其親本株的基因和蛋白質表達改變，尋找、發(fā)現(xiàn)新的白色念珠菌耐藥相關基因。2）克隆新耐藥基因，蛋白表達、分離、純化，分析蛋白的功能。3）分別構建新發(fā)現(xiàn)耐藥相關基因敲除的白色念珠菌及其高表達菌株，通過考察藥物敏感性、耐藥性形成、生物膜形成、菌絲形成、藥物外排、靶酶活性、基因表達調控、生長周期及其他相關基因表達等表型的差異，明確新發(fā)現(xiàn)的耐藥相關基因在耐藥性形成中的作用研究。（3）抗白色念珠菌耐藥性新途徑研究1）利用耐藥性白色念珠菌，從化合物庫（第二軍醫(yī)大學自有）中篩選抗耐藥白色念珠菌的新化合物，或氟康唑、伊曲康唑、兩性霉素B等現(xiàn)有抗真菌藥物的增敏劑。2）以耐藥優(yōu)勢變異白色念珠菌為篩選模型，從化合物庫中篩選抗耐藥優(yōu)勢變異的新化合物3）以CDR1或MDR1高表達的白色念珠菌為篩選模型，從化合物庫中篩選CDR1和MDR1的外排功能抑制劑創(chuàng)新點與特色1. 利用分子流行病學手段，全面研究我國多種耐藥病原體的耐藥性產生及傳播規(guī)律，通過對我國病原體的耐藥特點、耐藥基因變異及耐藥基因譜情況的掌握，指導耐藥性的防治。2. 對傳染病重要病原體進行數(shù)個全球創(chuàng)新性的耐藥機制研究，如對在我國發(fā)現(xiàn)的新耐藥基因、耐藥突變體進行進一步研究，將使人類對耐藥機制有更深入的認識，充實耐藥機制理論，如明確細菌對喹諾酮類的耐藥性是否也可通過質粒介導，解釋耐藥性上升迅速的原因。3. 通過本研究形成一些開創(chuàng)性的科學學說，如耐藥結核菌感染的病原菌來源學說；HBV耐藥變異可能導致“特異性T細胞表位HLA限制性漂移”學說等。4. 應用分子生物學手段，進行耐藥菌的快速診斷，提高療效。5. 開創(chuàng)性地進行抗耐藥性的新途徑研究，如在全球率先通過對HIV逆轉錄酶結構和功能的研究，篩選新型抗HIV藥物；篩選耐藥真菌的新抗真菌藥物?？尚行苑治?. 本項目參加單位均為在國內有一定名望、甚至在全球有一定影響的實驗室，已經作了大量與本課題密切相關的前期工作，所有參加單位均具有參與重大國家科技計劃如973計劃、科技攻關計劃、863計劃的經驗。2. 本項目參加單位均具有本研究所需的工作條件，包括較大面積的實驗室（參與HIV、HBV及細菌研究的單位分別具有相應的P3及P2實驗室）、相應的實驗平臺和大型儀器設備。3. 具有完備的科研梯隊，包括學術帶頭人、學術骨干、中青年學術帶頭人及實驗技術人員，年齡結構上具有以中青年為主的老、中、青梯隊。四、年度計劃年度研究內容預期目標第一年1. 耐藥病原體的分子流行病學研究：建立耐藥病原體菌種庫，分析主要耐藥基因型，基因分布，研究并建立耐藥檢測新技術。2. 耐藥基因的生物學特點，與藥物間相互關系研究：分析耐藥基因不同位置突變與耐藥之間的關系。3. 藥物與靶位相互作用研究：研究HIV1 RT/DNA在與核苷酸類似物（如AZT、3TC、PMEA等）結合狀態(tài)下的結構1. 明確主要耐藥菌特性、主要基因型及其在細菌耐藥性形成中的作用；建立結核初發(fā)病人菌株庫并進行DNA指紋分析；初步獲得AIDS未治療人群的耐藥本底，提供本底數(shù)據(jù)；建立白念珠菌菌種庫及其藥敏數(shù)據(jù)庫2. 對可能發(fā)現(xiàn)的細菌新基因型進行基因定位、表達；明確HBV對核苷類似物耐藥的發(fā)生頻率及規(guī)律。3. 初步了解HIV1 RT/DNA結構與藥物關系。第二年1. 分子流行病學研究：TB耐藥基因篩查，收集AIDS患者治療前和治療過程中血液標本，檢測基因型。2. 耐藥機制研究：耐藥菌細胞膜結構與耐藥關系研究，白念珠菌耐藥基因的變異、調控，病原變異序列特異性細胞免疫反應與耐藥關系。3. 藥物與靶位相互作用進一步研究：繼續(xù)研究HIV1 RT/DNA在與核苷酸類似物（如AZT、3TC、PMEA等）結合狀態(tài)下的結構1. 給出我國主要抗結核藥物耐藥性的耐藥基因發(fā)生特征；初步獲得體外藥物壓力篩選下的耐藥病毒株，藥物壓力濃度和耐藥出現(xiàn)的關系。2. 獲知外膜蛋白、主動外排系統(tǒng)在細菌耐藥中的作用；明確真菌基因變異與耐藥性關系；闡明抗病毒治療相關HBV耐藥變異是否導致表位免疫顯性的消長變化，與抗病毒治療應答的關系。3. 了解HIV1 RT催化的DNA聚合的機理，獲得在此復合物條件下這些藥物與它們相應分子靶標的相互作用的信息。第三年1. 耐藥病原體的分子流行病學研究：了解質粒介導喹諾酮類耐藥的分布，建立耐藥菌快速基因診斷方法，進一步隨訪治療過程中AIDS患者。2. 耐藥機制研究：篩查TB差異基因，比較表達蛋白差異，研究泵出機制，構建HBV全基因質粒，研究HBV的生物學特性、藥物敏感實驗，分析我國白念珠菌耐藥性形成的分子特點和蛋白質表達變異。3. 藥物與靶位相互作用進一步研究與新藥篩選：野生型和有抗性突變的HIV1 RT的結構比較研究，利用耐藥性白念珠菌，篩選抗耐藥白念珠菌的新化合物，或抗真菌藥物的增敏劑1. 明確質粒介導耐藥機制在喹諾酮類耐藥性形成中的作用；建立細菌基因鑒定方法；初步獲得HIV體外藥物篩選和體內耐藥毒株出現(xiàn)的關系。2. 篩查出新的TB耐藥基因與耐藥相關蛋白，發(fā)現(xiàn)或闡明新的耐藥機制；了解HBV耐藥變異株復制、轉錄、各種抗原的表達分泌及病毒顆粒包裝情況；了解白念珠菌耐藥性形成對基因和蛋白質表達的影響，發(fā)現(xiàn)新耐藥基因。3. 獲得更多的突變型HIV1 RT及其與抗病毒藥物復合物的的結構；建立抗耐藥白念珠菌新藥篩選模型。年度研究內容預期目標第四年1. 耐藥病原體的分子流行病學研究：分析耐藥菌基因序列，探索建立分子生物學耐藥譜檢測方法；進一步隨訪治療過程中AIDS患者。2. 耐藥機制研究：表達耐藥基因產物，了解其與作用靶位的相互作用；干擾素信號傳導系統(tǒng)對抗HBV病毒療效的影響。3. 新藥設計：通過對藥物靶位與藥物相互作用的結構、功能研究，設計新藥。1. 建立可檢測重要致病菌耐藥性的基因診斷方法；分析耐藥性毒株產生的時間、劑量與耐藥出現(xiàn)的關系及其變異的規(guī)律。2. 鑒定或明確新發(fā)現(xiàn)的TB耐藥基因與耐藥機制；證實Qnr蛋白對喹諾酮作用靶位的保護作用；了解宿主遺傳因素對干擾素治療HBV應答的影響。3. HIV藥物研究揭示抑制物結合口袋的結構、各種抑制物的特點與性質以及抑制物與形成抑制物結合口袋的氨基酸的相互作用方式；建立抗耐藥白念珠菌新藥篩選模型。第五年1. 耐藥病原體分子流行病學監(jiān)測：建立耐藥病原體的臨床監(jiān)測及耐藥測定的質量評價體系。2. 耐藥機制研究：耐藥菌表達蛋白的純化、作用位置的深入研究。3. 耐藥病原體新療法的研究：測定重要致病菌的MPC和“突變選擇窗”；繼續(xù)抗HIV、抗真菌新藥物設計。4. 資料匯總、論文及結題報告撰寫等。1. 建立HBV耐藥的臨床監(jiān)測及耐藥測定的質量評價體系，及早發(fā)現(xiàn)和合理防治耐藥性的產生。2. 明確Qnr蛋白的晶體構像，進一步確定了解其對喹諾酮作用靶位DNA旋轉酶A、B亞基的保護作用3. 改進現(xiàn)有的給藥方案，達到提高抗菌治療治愈率，減少耐藥菌產生；力爭獲得12種新藥，建立抗耐藥病原體新藥篩選模型。