體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)doc-資料下載頁(yè)
2025-07-15 05:20本頁(yè)面
【正文】 計(jì)算地西泮的剩余濃度以及N去甲地西泮的生成濃度。利用非線性回歸方程（Lineweaver Burk或 EadieHofstee方程），以地西泮濃度對(duì)其消除速率或N去甲地西泮生成速率作圖，分別計(jì)算米氏常數(shù)Km值和最大反應(yīng)濃度Vmax值。 注意事項(xiàng)1．親酯性藥物常用有機(jī)溶劑做溶劑，往微粒體孵育液中加底物溶液時(shí)，為保證酶活性，%。酶和NADPH在高溫時(shí)均容易失活，故孵育反應(yīng)前，微粒體及各種試劑均應(yīng)置冰浴中保存。2. 所用酶濃度和孵育時(shí)間需要優(yōu)化，酶濃度和孵育時(shí)間在線性范圍內(nèi)要求底物濃度被代謝量低于20%。在酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定中，底物濃度應(yīng)取1/3~3倍Km值范圍，并至少取6個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度需平行做3份，取平均值計(jì)算。3. 采用底物地西泮的消除量計(jì)算獲得的Km值與采用產(chǎn)物N地西泮的生成量計(jì)算獲得的Km值不相同。這是因?yàn)橐缘孜锵坑?jì)算的Km值反映的是鼠肝微粒體中所有能催化地西泮一相代謝的酶的總活性，而以N去甲地西泮的生成量計(jì)算獲得的Km值針對(duì)的是其中能代謝地西泮生成N去甲基代謝物的酶的活性。 參考文獻(xiàn)[1] 匡唐永,，1995,9(2):81.[2] 劉菊芳,，1995,30（9）：655.9 對(duì)乙酰氨基酚代謝物的LCMS鑒定 目的要求／MS法鑒定代謝產(chǎn)物的方法。 主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器對(duì)乙酰氨基酚（paracetamol），分析純CMCNa，色譜純甲醇、甲酸、甲酸銨；LCMS聯(lián)用儀，大鼠代謝籠、手術(shù)臺(tái)。 實(shí)驗(yàn)原理收集服藥大鼠的尿液和膽汁，用LCMS／MS法檢測(cè)。通過(guò)總離子流掃描，提取底物和各代謝產(chǎn)物的分子離子峰，獲得各種代謝產(chǎn)物的分子量，再采用子離子掃描法進(jìn)一步確證代謝物。對(duì)乙酰氨基酚的代謝途徑見(jiàn)圖： 實(shí)驗(yàn)方法：分析柱為C18柱（150mm，5μm）；%甲酸的10mmol／L甲酸鈉溶液（A）甲醇(B)，采用梯度洗脫方式，20min內(nèi)（A）相從95%線性下降至30%；／min。MS條件：電噴霧（ESI）離子源，源溫度350℃，正離子電離模式，采用全掃描模式和子離子掃描模式檢測(cè)。：取對(duì)乙酰氨基酚適量，用1%的CMCNa溶液研磨，配制成6mg／mL的溶液。（1）尿樣采集：按60mg／kg的給藥劑量灌胃給予大鼠，并將大鼠放在代謝籠中，自由飲水。在給藥前和給藥后6h內(nèi)分別收集尿樣。4℃保存?zhèn)溆?。?）膽汁采集：用乙醚將大鼠麻醉，并將四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，打開(kāi)腹腔，進(jìn)行膽管插管。然后按60mg／kg的給藥劑量灌胃給予大鼠，繼續(xù)收集膽汁，4℃保存?zhèn)溆谩＃?）樣品處理：取適量尿液和膽汁，用蒸餾水1:1稀釋?zhuān)⒓尤?倍體積的甲醇，渦旋，收集濾液備用。4. 樣品分析（1）全掃描分析：對(duì)上述樣品進(jìn)行分析，獲得全掃描總離子流圖，離子掃描范圍為100~500m／z。采用離子提取的方法，提取底物和各代謝產(chǎn)物的分子離子峰，，。 注意事項(xiàng)。無(wú)機(jī)鹽的濃度過(guò)高可能導(dǎo)致嚴(yán)重的基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此需要稀釋后進(jìn)樣。另外，可以通過(guò)加入蛋白質(zhì)沉淀劑去除蛋白，常用的為加入甲醇或乙腈等有機(jī)溶劑。，最好是先找到胃，向下找到十二指腸乳頭部，再往肝臟方向找，能發(fā)現(xiàn)韌帶樣的組織，中間有一根很細(xì)的白管，有時(shí)是嫩黃色的，這就是膽管，用鑷柄墊在下方，用另一只尖鑷子小心的剝離脂肪組織，只要分理處半厘米長(zhǎng)度就足夠插管了，注意分離好后用手術(shù)線系住近腸端，方便固定，然后再剪一個(gè)小口，導(dǎo)管插口也要注意剪成斜面，這樣便于插管。，不同的色譜柱和不同型號(hào)的LCMS，它們的最佳分析條件不同，因此，在進(jìn)行代謝產(chǎn)物掃描時(shí)需要進(jìn)行條件的優(yōu)化。（示教） 目的要求熟悉微透析技術(shù)的原理和方法。 主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器丹參素（danshensu）和丹參素對(duì)照品，色譜級(jí)甲醇，分析純水合氯醛、冰醋酸；微透析設(shè)備（包括灌注器推進(jìn)泵、灌注器、灌注器支架、流速控制器），微透析探針，高效液相色譜儀；SD雄性大鼠（300g）。頸動(dòng)脈微透析套件：該套件包括微透析探針、探針導(dǎo)管及導(dǎo)管阻塞管和導(dǎo)管固定器。探針導(dǎo)管由柔軟的醫(yī)用導(dǎo)管構(gòu)成，一端插入血管，另一端可從皮下穿行到背部開(kāi)口。導(dǎo)管固定裝置是一個(gè)帶有翼片的裝置，翼片埋置在皮下，中間有通孔將導(dǎo)管從皮下引出，并固定在導(dǎo)管固定器的立柱上，從而使導(dǎo)管開(kāi)口端固定在了動(dòng)物背部。導(dǎo)管從血管端到固定端穿行中無(wú)尖銳轉(zhuǎn)角，方便微透析探針的插入與取出。微透析探針是與導(dǎo)管相匹配的軟探針，膜端為同軸結(jié)構(gòu)，再生纖維素膜（spectrum USA）膜長(zhǎng)10mm，截留相對(duì)分子質(zhì)量為18000。微透析技術(shù)是利用“物質(zhì)會(huì)沿濃度梯度進(jìn)行擴(kuò)散”和“半透膜對(duì)小分子化合物具有通透性”的原理設(shè)計(jì)的。當(dāng)把探針埋入組織后，由于灌流液的組成與組織細(xì)胞外液的組成相近，滲透壓相同，水分子不會(huì)進(jìn)入探針內(nèi)，大分子化合物如蛋白或與蛋白結(jié)合的藥物等不能通過(guò)半透膜而被排斥在探針外，只有游離的小分子藥物或者其他小分子物質(zhì)會(huì)沿濃度梯度擴(kuò)散進(jìn)入探針，并被灌流液帶出探針。將微透析采樣技術(shù)與HPLC法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)藥物在體內(nèi)的生物學(xué)過(guò)程。 實(shí)驗(yàn)方法：色譜柱為C18柱（250mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇1%醋酸水溶液（18:20），流速1mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。：精密稱(chēng)取丹參素對(duì)照品適量，用生理鹽水配制成1mg/mL的儲(chǔ)備液，通過(guò)逐級(jí)稀釋的方法配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（60~10000ng/mL），取10μL進(jìn)樣分析，以丹參素濃度對(duì)峰面積進(jìn)行回歸，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。：按40mg/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，然后將其固定在大鼠手術(shù)臺(tái)上。暴露右頸外靜脈，在靜脈鎖骨分叉處上游約10mm處向心方向插入微透析導(dǎo)管，導(dǎo)管前段至頸靜脈上肢分枝上緣，用線固定血管和導(dǎo)管，并用線將導(dǎo)管固定在肌肉層上。將導(dǎo)管的另一端在穿刺針引導(dǎo)下從頸背部引出，并用導(dǎo)管固定裝置將導(dǎo)管固定。在左大腿內(nèi)側(cè)皮膚剪一切口，暴露股靜脈，將靜脈給藥導(dǎo)管（PE20）插入股靜脈并固定。用穿刺針引導(dǎo)將給藥導(dǎo)管的活動(dòng)端從皮下引出到頸背部，并固定。，以防止凝血。然后用盲管封住導(dǎo)管出口端。術(shù)后每天肌注青霉素2萬(wàn)單位消炎?；謴?fù)3d后。進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)。4．藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)：取5只預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)大鼠，將微透析導(dǎo)管上封口管去除，然后將微透析探針沿微透析導(dǎo)管插入大鼠頸靜脈內(nèi)，用導(dǎo)管將微透析探針的進(jìn)樣管與出樣管分別通過(guò)液體旋轉(zhuǎn)聯(lián)接到微透析泵和收集器上。聯(lián)接好管路后，將大鼠放入微透析實(shí)驗(yàn)桶，生理鹽水作為灌注液，灌注流速2μL/min，進(jìn)行探針平衡。平衡30min后開(kāi)始收集透析液，每7min收集一管，連續(xù)收集3管。去除給藥導(dǎo)管上的盲管，然后按40mg/kg給藥量注入16mg/kg丹參素標(biāo)準(zhǔn)液，再次用盲管封住給藥導(dǎo)管出口端。此后實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠可自由活動(dòng)。給藥后10min（去除出液管中積存的液體）開(kāi)始每7min收集一次透析液，70min后每15min收集一次透析液，160min后每30min收集一次透析液。然后取各透析液10μL，直接注入HPLC儀進(jìn)行分析，將測(cè)得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)濃度，用動(dòng)力學(xué)擬合軟件計(jì)算丹參素藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。 注意事項(xiàng)。因制作工藝等因素影響，每只微透析探針的回收率各不相同，因此實(shí)驗(yàn)前必須對(duì)每只微透析探針進(jìn)行回收率的測(cè)量，并編號(hào)記錄。，故樣品處理過(guò)程中不需要進(jìn)行去蛋白處理，可以直接進(jìn)行HPLC分析。 參考文獻(xiàn)呂良，2010,45（11）：849.35 /
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