【正文】 計算地西泮的剩余濃度以及N去甲地西泮的生成濃度。利用非線性回歸方程（Lineweaver Burk或 EadieHofstee方程），以地西泮濃度對其消除速率或N去甲地西泮生成速率作圖，分別計算米氏常數(shù)Km值和最大反應濃度Vmax值。 注意事項1．親酯性藥物常用有機溶劑做溶劑，往微粒體孵育液中加底物溶液時，為保證酶活性，%。酶和NADPH在高溫時均容易失活，故孵育反應前，微粒體及各種試劑均應置冰浴中保存。2. 所用酶濃度和孵育時間需要優(yōu)化，酶濃度和孵育時間在線性范圍內(nèi)要求底物濃度被代謝量低于20%。在酶動力學測定中，底物濃度應取1/3~3倍Km值范圍，并至少取6個濃度水平，每個濃度需平行做3份，取平均值計算。3. 采用底物地西泮的消除量計算獲得的Km值與采用產(chǎn)物N地西泮的生成量計算獲得的Km值不相同。這是因為以底物消除量計算的Km值反映的是鼠肝微粒體中所有能催化地西泮一相代謝的酶的總活性，而以N去甲地西泮的生成量計算獲得的Km值針對的是其中能代謝地西泮生成N去甲基代謝物的酶的活性。 參考文獻[1] 匡唐永,，1995,9(2):81.[2] 劉菊芳,，1995,30（9）：655.9 對乙酰氨基酚代謝物的LCMS鑒定 目的要求／MS法鑒定代謝產(chǎn)物的方法。 主要實驗材料與儀器對乙酰氨基酚（paracetamol），分析純CMCNa，色譜純甲醇、甲酸、甲酸銨；LCMS聯(lián)用儀，大鼠代謝籠、手術(shù)臺。 實驗原理收集服藥大鼠的尿液和膽汁，用LCMS／MS法檢測。通過總離子流掃描，提取底物和各代謝產(chǎn)物的分子離子峰，獲得各種代謝產(chǎn)物的分子量，再采用子離子掃描法進一步確證代謝物。對乙酰氨基酚的代謝途徑見圖： 實驗方法：分析柱為C18柱（150mm，5μm）；%甲酸的10mmol／L甲酸鈉溶液（A）甲醇(B)，采用梯度洗脫方式，20min內(nèi)（A）相從95%線性下降至30%；／min。MS條件：電噴霧（ESI）離子源，源溫度350℃，正離子電離模式，采用全掃描模式和子離子掃描模式檢測。：取對乙酰氨基酚適量，用1%的CMCNa溶液研磨，配制成6mg／mL的溶液。（1）尿樣采集：按60mg／kg的給藥劑量灌胃給予大鼠，并將大鼠放在代謝籠中，自由飲水。在給藥前和給藥后6h內(nèi)分別收集尿樣。4℃保存?zhèn)溆谩＃?）膽汁采集：用乙醚將大鼠麻醉，并將四肢固定于手術(shù)臺上，打開腹腔，進行膽管插管。然后按60mg／kg的給藥劑量灌胃給予大鼠，繼續(xù)收集膽汁，4℃保存?zhèn)溆?。?）樣品處理：取適量尿液和膽汁，用蒸餾水1:1稀釋，并加入2倍體積的甲醇，渦旋，收集濾液備用。4. 樣品分析（1）全掃描分析：對上述樣品進行分析，獲得全掃描總離子流圖，離子掃描范圍為100~500m／z。采用離子提取的方法，提取底物和各代謝產(chǎn)物的分子離子峰，，。 注意事項。無機鹽的濃度過高可能導致嚴重的基質(zhì)抑制效應，因此需要稀釋后進樣。另外，可以通過加入蛋白質(zhì)沉淀劑去除蛋白，常用的為加入甲醇或乙腈等有機溶劑。，最好是先找到胃，向下找到十二指腸乳頭部，再往肝臟方向找，能發(fā)現(xiàn)韌帶樣的組織，中間有一根很細的白管，有時是嫩黃色的，這就是膽管，用鑷柄墊在下方，用另一只尖鑷子小心的剝離脂肪組織，只要分理處半厘米長度就足夠插管了，注意分離好后用手術(shù)線系住近腸端，方便固定，然后再剪一個小口，導管插口也要注意剪成斜面，這樣便于插管。，不同的色譜柱和不同型號的LCMS，它們的最佳分析條件不同，因此，在進行代謝產(chǎn)物掃描時需要進行條件的優(yōu)化。（示教） 目的要求熟悉微透析技術(shù)的原理和方法。 主要實驗材料與儀器丹參素（danshensu）和丹參素對照品，色譜級甲醇，分析純水合氯醛、冰醋酸；微透析設(shè)備（包括灌注器推進泵、灌注器、灌注器支架、流速控制器），微透析探針，高效液相色譜儀；SD雄性大鼠（300g）。頸動脈微透析套件：該套件包括微透析探針、探針導管及導管阻塞管和導管固定器。探針導管由柔軟的醫(yī)用導管構(gòu)成，一端插入血管，另一端可從皮下穿行到背部開口。導管固定裝置是一個帶有翼片的裝置，翼片埋置在皮下，中間有通孔將導管從皮下引出，并固定在導管固定器的立柱上，從而使導管開口端固定在了動物背部。導管從血管端到固定端穿行中無尖銳轉(zhuǎn)角，方便微透析探針的插入與取出。微透析探針是與導管相匹配的軟探針，膜端為同軸結(jié)構(gòu)，再生纖維素膜（spectrum USA）膜長10mm，截留相對分子質(zhì)量為18000。微透析技術(shù)是利用“物質(zhì)會沿濃度梯度進行擴散”和“半透膜對小分子化合物具有通透性”的原理設(shè)計的。當把探針埋入組織后，由于灌流液的組成與組織細胞外液的組成相近，滲透壓相同，水分子不會進入探針內(nèi)，大分子化合物如蛋白或與蛋白結(jié)合的藥物等不能通過半透膜而被排斥在探針外，只有游離的小分子藥物或者其他小分子物質(zhì)會沿濃度梯度擴散進入探針，并被灌流液帶出探針。將微透析采樣技術(shù)與HPLC法結(jié)合，實現(xiàn)在線監(jiān)測藥物在體內(nèi)的生物學過程。 實驗方法：色譜柱為C18柱（250mm，5μm）；流動相為甲醇1%醋酸水溶液（18:20），流速1mL/min；紫外檢測波長280nm。：精密稱取丹參素對照品適量，用生理鹽水配制成1mg/mL的儲備液，通過逐級稀釋的方法配制系列標準溶液（60~10000ng/mL），取10μL進樣分析，以丹參素濃度對峰面積進行回歸，獲得標準曲線。：按40mg/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，然后將其固定在大鼠手術(shù)臺上。暴露右頸外靜脈，在靜脈鎖骨分叉處上游約10mm處向心方向插入微透析導管，導管前段至頸靜脈上肢分枝上緣，用線固定血管和導管，并用線將導管固定在肌肉層上。將導管的另一端在穿刺針引導下從頸背部引出，并用導管固定裝置將導管固定。在左大腿內(nèi)側(cè)皮膚剪一切口，暴露股靜脈，將靜脈給藥導管（PE20）插入股靜脈并固定。用穿刺針引導將給藥導管的活動端從皮下引出到頸背部，并固定。，以防止凝血。然后用盲管封住導管出口端。術(shù)后每天肌注青霉素2萬單位消炎。恢復3d后。進行藥動學實驗。4．藥動學實驗：取5只預處理的實驗大鼠，將微透析導管上封口管去除，然后將微透析探針沿微透析導管插入大鼠頸靜脈內(nèi)，用導管將微透析探針的進樣管與出樣管分別通過液體旋轉(zhuǎn)聯(lián)接到微透析泵和收集器上。聯(lián)接好管路后，將大鼠放入微透析實驗桶，生理鹽水作為灌注液，灌注流速2μL/min，進行探針平衡。平衡30min后開始收集透析液，每7min收集一管，連續(xù)收集3管。去除給藥導管上的盲管，然后按40mg/kg給藥量注入16mg/kg丹參素標準液，再次用盲管封住給藥導管出口端。此后實驗過程中大鼠可自由活動。給藥后10min（去除出液管中積存的液體）開始每7min收集一次透析液，70min后每15min收集一次透析液，160min后每30min收集一次透析液。然后取各透析液10μL，直接注入HPLC儀進行分析，將測得的峰面積代入標準曲線計算相應濃度，用動力學擬合軟件計算丹參素藥動學參數(shù)。 注意事項。因制作工藝等因素影響，每只微透析探針的回收率各不相同，因此實驗前必須對每只微透析探針進行回收率的測量，并編號記錄。，故樣品處理過程中不需要進行去蛋白處理，可以直接進行HPLC分析。 參考文獻呂良，2010,45（11）：849.35 /