【正文】 失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞 　　PCR反應體系與反應條件 　　標準的PCR反應體系： 　　10擴增緩沖液 10ul 　　4種dNTP混合物 各200umol/L 　　引物 各10～100pmol　 　　模板DNA ～2ug　 　　Taq DNA聚合酶 　 　　Mg2+　　　加雙或三蒸水至 100ul 　　PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 　　引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。 　　設計引物應遵循以下原則： 　　①引物長度： 1530bp，常用為20bp左右。 　?、谝飻U增跨度： 以200500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 　?、垡飰A基：G+C含量以4060%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 　?、鼙苊庖飪?nèi)部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是339。端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 　?、菀?39。端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。 　?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。 　?、咭锏奶禺愋裕阂飸c核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： ～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。 　　酶及其濃度　目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。 　　dNTP的質(zhì)量與濃度　dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris?！?，小量分裝，20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。 　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 　　Mg2+濃度　Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+～。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。 　　PCR反應條件的選擇 　　PCR反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。 　　溫度與時間的設置：基于PCR原理三步驟而設置變性退火延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。 　　①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導致PCR失敗。 　　②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： 　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T) 　　復性溫度=Tm值(5～10℃) 　　在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。 　?、垩由鞙囟扰c時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性： 　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子 　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子 　　高于90℃時， DNA合成幾乎不能進行。 　　PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。 [編輯本段]PCR實驗室的建立方法實驗室布局　　PCR實驗室按規(guī)定需要四間，分別是1 試劑儲存和準備區(qū)、2 標本制備區(qū)、3擴增反應混合物配制和擴增區(qū)、4擴增產(chǎn)物分析區(qū),布局見圖1。 　　圖1 四間PCR實驗室區(qū)域設置 　　如果使用全自動分析儀，各區(qū)域可適當合并，我們建議將擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)合并為擴增檢測區(qū)即共三個間，布局見圖2。 　　圖2 三間PCR實驗室區(qū)域設置 　　按國家衛(wèi)生部的要求，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑儲存和準備區(qū)?標本制備區(qū)擴增反應混合物配制和擴增區(qū)?擴增產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。各工作區(qū)必須安裝適當?shù)呐棚L設備確?？諝饬飨虬磫我环较?。工作區(qū)的墻面、地面、辦公用品等必須選用耐消毒藥品腐蝕的材料。工作區(qū)必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品混用。 設置標準　　各工作區(qū)域必須配備排風扇、空調(diào)、耐腐蝕地面和工作臺面、更衣柜、鞋柜、專用辦公用品、專用工作服和工作鞋、移動紫外燈等，保證安全衛(wèi)生需要。 　　根據(jù)國家衛(wèi)生部《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》，各工作區(qū)域必備儀器設備如下： （一） 試劑儲存和準備區(qū)　　28℃和15℃冰箱 　　混勻器 　　微量加樣器（覆蓋11000μl） 　　移動紫外燈（近工作臺面） 　　消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 　　專用工作服和工作鞋 　　專用辦公用品 （二）標本制備區(qū)　　28℃冰箱、20℃或80℃冰箱 　　高速臺式冷凍離心機 　　混允器 　　水浴箱或加熱模塊 　　微量加樣器（覆蓋11000μl） 　　可移動紫外燈（近工作臺面） 　　超凈工作臺 　　消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 　　專用工作服和工作鞋 　　專用辦公用品 　　如需處理大分子DNA，應具有超聲波水浴儀。 （三）基因擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)　　 全自動定量核酸擴增儀（含計算機、打印機） 　　 微量加樣器（覆蓋11000μl） 　　 可移動紫外燈（近工作臺面） 　　 消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 　　 專用工作服和工作鞋 　　 專用辦公用品 　　各工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品混用。在不同的工作區(qū)域應使用不同顏色或有明顯區(qū)別標志的工作服，以便于鑒別。當工作者離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。 　　實驗室質(zhì)量管理 　　PCR實驗室內(nèi)工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，并持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結果準確、確保實驗室衛(wèi)生安全，確保實驗室長期穩(wěn)定運行。22 / 22