【正文】 失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞 　　PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 　　標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系： 　　10擴(kuò)增緩沖液 10ul 　　4種dNTP混合物 各200umol/L 　　引物 各10～100pmol　 　　模板DNA ～2ug　 　　Taq DNA聚合酶 　 　　Mg2+　　　加雙或三蒸水至 100ul 　　PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 　　引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。 　　設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： 　　①引物長度： 1530bp，常用為20bp左右。 　　②引物擴(kuò)增跨度： 以200500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。 　?、垡飰A基：G+C含量以4060%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 　?、鼙苊庖飪?nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是339。端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 　　⑤引物339。端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。 　　⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。 　?、咭锏奶禺愋裕阂飸?yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： ～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。 　　酶及其濃度　目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。 　　dNTP的質(zhì)量與濃度　dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris?！?，小量分裝，20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。 　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 　　Mg2+濃度　Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+～。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。 　　PCR反應(yīng)條件的選擇 　　PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。 　　溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性退火延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。 　?、僮冃詼囟扰c時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。 　?、谕嘶?復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： 　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T) 　　復(fù)性溫度=Tm值(5～10℃) 　　在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 　?、垩由鞙囟扰c時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性： 　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子 　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子 　　高于90℃時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。 　　PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些。 [編輯本段]PCR實(shí)驗(yàn)室的建立方法實(shí)驗(yàn)室布局　　PCR實(shí)驗(yàn)室按規(guī)定需要四間，分別是1 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、2 標(biāo)本制備區(qū)、3擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、4擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū),布局見圖1。 　　圖1 四間PCR實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置 　　如果使用全自動(dòng)分析儀，各區(qū)域可適當(dāng)合并，我們建議將擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)合并為擴(kuò)增檢測區(qū)即共三個(gè)間，布局見圖2。 　　圖2 三間PCR實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置 　　按國家衛(wèi)生部的要求，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)?標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)?擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。各工作區(qū)必須安裝適當(dāng)?shù)呐棚L(fēng)設(shè)備確?？諝饬飨虬磫我环较颉９ぷ鲄^(qū)的墻面、地面、辦公用品等必須選用耐消毒藥品腐蝕的材料。工作區(qū)必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)　　各工作區(qū)域必須配備排風(fēng)扇、空調(diào)、耐腐蝕地面和工作臺(tái)面、更衣柜、鞋柜、專用辦公用品、專用工作服和工作鞋、移動(dòng)紫外燈等，保證安全衛(wèi)生需要。 　　根據(jù)國家衛(wèi)生部《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》，各工作區(qū)域必備儀器設(shè)備如下： （一） 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)　　28℃和15℃冰箱 　　混勻器 　　微量加樣器（覆蓋11000μl） 　　移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面） 　　消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 　　專用工作服和工作鞋 　　專用辦公用品 （二）標(biāo)本制備區(qū)　　28℃冰箱、20℃或80℃冰箱 　　高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 　　混允器 　　水浴箱或加熱模塊 　　微量加樣器（覆蓋11000μl） 　　可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面） 　　超凈工作臺(tái) 　　消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 　　專用工作服和工作鞋 　　專用辦公用品 　　如需處理大分子DNA，應(yīng)具有超聲波水浴儀。 （三）基因擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)　　 全自動(dòng)定量核酸擴(kuò)增儀（含計(jì)算機(jī)、打印機(jī)） 　　 微量加樣器（覆蓋11000μl） 　　 可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面） 　　 消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 　　 專用工作服和工作鞋 　　 專用辦公用品 　　各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。當(dāng)工作者離開工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。 　　實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理 　　PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗(yàn)中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增培訓(xùn)班，并持證上崗。PCR實(shí)驗(yàn)室通過驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)室至少必須應(yīng)有兩個(gè)以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確、確保實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生安全，確保實(shí)驗(yàn)室長期穩(wěn)定運(yùn)行。22 / 22