【正文】 ign→Alignment Setup 進行 圖 使用 Alignment Setup，調(diào)整序列比對的計算條件跟參數(shù) ，除非對 Alignment 的計算方式有特殊需 求，在此不建議擅自更改任何參數(shù)和設(shè)定。 Dot Matrix： Dot Matrix 可以在兩條序列間找出相吻合的部分，這個方法可以用來尋找序列中重復 的片段。 例如用在 RNA 序列可以預測二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域。 要進行 Dot Matrix 只要按下 或是從 Align→Show Dot Matrix Plot 進入： 圖 在左邊及右邊選單，各選擇一組序列進行比對 (圖 )中要先選好兩組序列， 在窗口上方中， 左邊的序列為橫坐標； 右邊的序列為縱坐標。選好兩組序列后，程序會繪制出比對結(jié)果(圖 )：圖 兩個序列比對后的結(jié)果 比對結(jié)果(圖 )可以用鼠標左鍵拖曳放大直到看的清楚為止： ； 則是可以用來畫網(wǎng)格線進行比對(圖 )： 圖 增加網(wǎng)格線的比對結(jié)果 一開始使用 Dot Matrix Plot 比對出來的序列并不正確，使用者必須調(diào)整兩項參數(shù) ，可以按下 或是從上方 Matrix→Matrix Setup 做調(diào)整： 圖 Stringency 越小越嚴謹，Window 越大圖形越長 窗口(圖 )中有兩個項目會影響分析的結(jié)果，一個是 Stringency。另一個是 Window。前者是表示比對的嚴謹度，數(shù)值越小越嚴謹。后者表示相似序列的長度，數(shù) 值越大圖形越長。進行 Dot Matrix 功能時，用戶必須調(diào)整此兩數(shù)值到最佳狀態(tài)，才會 得到最佳的結(jié)果， 下列幾個圖形范例(圖 )， 是用不同的數(shù)值所表現(xiàn)出不同的分 析結(jié)果：圖 Stringency=1，Window=1 圖 Stringency=1，Window=10 ，Window=10 圖 Stringency=40，Window=1 ： 在 NTI 主程序中選取 Analyses→Primer design→Alignment PCR List 時會出現(xiàn)一個 Alignment PCR 窗口(圖 )于主程序下方：圖 使用 Alignment PCR List 比對 選擇 Add 或是 Load 把要比對的序列檔案加載(圖 )：圖 點選 Add 或 Load 載入比對的序列 (圖 )：圖 執(zhí)行比對，會開啟 AlignX 的窗口 接著進行序列比對(圖 )：圖 進行序列比對 在比對的序列部分選取好要 PCR 的范圍按下鼠標右鍵點選 Design PCR Primers (圖 )： ，進行 Primer 的設(shè)計 這時就會出現(xiàn) Primer 設(shè)計的頁面(圖 )：圖 設(shè)定 Primer 的結(jié)果 接下來就依照自己的需求設(shè)計 Primer，注意在 Amplicon Length Min 的項目不可以 設(shè)定比選取的范圍長。設(shè)定好后按下確定就會出現(xiàn) primer 的數(shù)據(jù)(圖 )： 。 　 AlignX Blocks AlignX Blocks 可以用在蛋白質(zhì)序列比對，和 AlignX 不同的地方在于比對的 序列會以圖形表示比對的結(jié)果。 　 啟動 AlignX Blocks 的方式和 AlignX 是一樣的，可直接開啟或是從主程序上 方開啟(圖 )：圖 直接于程序集中開啟 AlignX Blocks 圖 于 Vector NTI 程序內(nèi)開啟 AlignX Blocks (圖 )：圖 開啟 AlignX 程序后的接口 首先用戶要把序列檔案加載程序里面，可以點選 或者從左上方的 Project →Add Files 把序列檔案載入，序列只能分析蛋白質(zhì)序列(圖 )：圖 利用 Project→Add Files 將序列加載到左上窗口 (圖 )，操作和 AlignX 相同：圖 全選欲進行比對的序列 比對前可以依各人需求調(diào)整序列比對的條件跟參數(shù)(圖 )?？牲c選 是從 Blocks→AlignX Blocks Setup 進行調(diào)整：圖 參數(shù)的設(shè)定會影響程序的運算，要適當?shù)恼{(diào)整得到所要的結(jié)果 或 參數(shù)的設(shè)定會影響到程序的運算，并造成不同的比對結(jié)果。使用者可針對這 三個參數(shù)進行調(diào)整，直到得到滿意的結(jié)果為止。 ’colors 項目(圖 )表示比對后各序列相似區(qū)域所顯示的顏色，默認 值為紅色，可以依照喜好設(shè)定顏色。圖 Blocks’ colors 改變顯示的顏色 和 AlignX 相同，使用者也可以設(shè)定 Score matrix 的參數(shù)(圖 )，但是不建 議一般使用者更改。圖 更改 Score matrix 的參數(shù)， →Search for blocks 程序進行運算， 經(jīng)運算完成之后會出現(xiàn)下面的畫面：圖 運算的結(jié)果：左下為相似的區(qū)域，右上為序列的圖形顯示，右下為比對的畫面 在左下的窗口(圖 )中所顯示的是程序依照蛋白質(zhì)序列和設(shè)定的參數(shù)所比 對出相似的區(qū)域，此區(qū)域稱之為 block； 右上方的窗口是把比對的序列以圖形顯示， 可以判別 block 之間的位置關(guān)系； 右下方則是序列的比對畫面。 在左下方顯示的區(qū)塊中， 使用者可以看到紅色的圓圈(圖 )， 表示該 block 會以紅色顯示在右邊的圖形跟序列比對窗口， 旁邊會有程序計算后的一些分數(shù)跟 統(tǒng)計值。 只要用鼠標點選圓圈的部分，就會在右邊的窗口顯示該部分： ，對應(yīng)到左下窗口的紅點 若要編輯 block 可以點選欲修改的部分后， 按下鼠標右鍵選擇 Edit block 或是 點選主程序上方 (圖 )：圖 編輯或修改相似的區(qū)域，點選 Edit block 在編輯的窗口下，用戶可以在下方為此 block 命名及修改顏色(圖 )，在 左上方使用者可以選擇比對的序列。 想要回復原來的設(shè)定只要點選 Restore to original 即可。 ，只要按下 OK 就會依使用者的需求展示比對 圖譜，圖 是把其中一個 block 命名為 JST，顏色改成黃綠色：圖 將其中一組 block 命名為 JST，并將顏色改成黃綠色 (圖 )：圖 以不同的顏色代表不同的 block 如果想要把蛋白質(zhì)序列中的 block 放在同一直列觀察，可以將特定的 block 點選后下按 或是從 Blocks→Link 將各序列的 block 放在同一列(圖 )：圖 將各序列的 block 放在同一列中觀察 。 如果想要取消此功能只要按下 或是 Blocks→Unlink 就可以恢復原狀。如果操 或是 來看其前后操作。 作許多不同的 block 造成比較多的 link 狀況可以用 使用者可以依照自己的需求將不同的 block 進行不同的 link(圖 )：圖 觀察多組序列的 block 右邊的圖形和序列比對可以利用鼠標右鍵的 Camera 進行輸出(圖 )：圖 將序列比對結(jié)果輸出 用戶操作的結(jié)果和 AlignX 一樣可從 Project 項目進去后選擇 Save 或者是 Save as 進行儲存，以后只要直接打開儲存的檔案就可以了。 　 序列串接　 使用Vector NTI中的ContigExpress程序()可利用序列相似度，將小片段序 列進行串連。此程序可以將單純序列文本文件或是由定序出來的訊號檔案直接進行 分析， 串接后的片段稱為Contigs， 在進行長片段的序列定序或是genomic library定序 時非常實用。 使用ContigExpress將小片段序列串接 將小片段的序列串接成完整大片段序列的方式如下之操作過程。 可以直接開啟或是從主程序項目開啟 ContigExpress 程序(圖 )： 利用程序集開啟ContigExpress程序 ，此畫面會分為左右兩個區(qū)塊：圖 ContigExpress 程序產(chǎn)生的兩個區(qū)塊 　 在此窗口中，用戶要先加入序列的檔案。 一般序列的文本文件格式都可以加入程序中，而含有定序訊號的序列檔案一般 都為 abi 的文件格式，如果沒有相關(guān)的程序是無法讀取進行分析，而 ContigExpress 可以讀取和分析這種類型的檔案。 要將序列檔案或是定序的 abi 檔案加載程序中的話，只要選擇 Project→Add Fragments 就可以選擇要加載程序的檔案了(圖 )： →Add Fragments 加載程序的檔案 用戶可以從窗口的左邊的 Fragments(圖 )按下右鍵后選擇 Add Fragments 加入序列檔案：圖 在 Fragments 右鍵單擊加入序列檔案 ，可按住 Ctrl 鍵后用鼠標進行復選(圖 )：圖 可利用 Ctrl 鍵，選取多個檔案 點選開啟后，如果程序出現(xiàn)一連串的警告聲并出現(xiàn)是否的尋問，那只是文件名 一致性的修正詢問，使用者可以忽略該狀態(tài)并持續(xù)點選“是”的選項直到所有檔案 加載全程序為止(圖 )。圖 載入序列后的結(jié)果 想要看每個 abi 檔案的訊號可以將加載的訊號文件用鼠標點選打開(圖 )： ，下方為序列定序的訊號 打開檔案后會出現(xiàn)一個窗口(圖 )，右邊是該檔案的序列；下面是序列在定 序過程時的訊號。用戶可以把光標移到訊號上方的文字，就可以看到該訊號每個堿 基 A、T、C、G 的訊號強度(圖 )：圖 將光標移置訊號上方，可看到該訊號的每個堿基強度 ，每個顏色代表不同的堿基判讀。如果只想看單一個堿基的 訊號可以用上方的 按鈕關(guān)掉不想讓系統(tǒng)顯示的訊號：圖 判讀單一個堿基 圖 為關(guān)掉 T 和 G 訊號后的范例。 訊號的部分可以放大觀察，用戶只要在訊號圖譜上面選取要觀看的序列后，并 按下鼠標右鍵選擇 Zoom In 就可以把選擇的區(qū)域放大(圖 )：圖 放大或縮小圖譜 ： 要進行序列串接時首先要把欲串接的檔案(圖 )用鼠標選取（可復選） ，選 好之后按下 就會進行串接的動作：圖 選取要串接的序列 串接完成以后會出現(xiàn)一個名稱叫 Contig 的檔案(圖 )， 下方會顯示此檔案所 包含的串接序列：圖 串接完后產(chǎn)生 Contig 檔案，而下方顯示其包含的序列 點選此檔案后就會看到串接好的畫面(圖 )： ，產(chǎn)生的箭頭方向為串接的方向 在這畫面中使用者可以看到串接的情況，會以右上方的圖片表示，圖片上面的 兩個長條形是每個串接的序列， 箭頭是串接的方向。 圖片下面是整個接起來的全長， 紅色網(wǎng)格線區(qū)域則是串接迭合（overlap）的部分。最下面 Contig 的部分是整個串接 后全長的文字序列；上面則是串接的部分檔案的文字序列。 串接好的序列大部分會出現(xiàn)序號干擾的問題，此問題在于定序的訊號在定序開 始和結(jié)束的時候會特別不穩(wěn)定，這些不穩(wěn)定的部分大都會造成序列判斷的錯誤，用 戶首先需先了解訊號圖譜可以相信的部分，此部分的訊號峰值相當尖且單純；訊號 不穩(wěn)定的部分峰值平緩且有許多噪聲重迭： ，較為平緩的訊號較容易判斷錯誤 C C 2357 T G T T C C G A C C C T G C C G C T T A A C A G G A T A C C T G T C C G C C T Fr agment E1 2_T7 0 C C 999 T 1 001 G T T 1 003 C C G A C C C 1 005 1 007 1 009 1 1 01 T G 1 3 01 C C 1 5 01 G C T T A A C A G G A T A 1 7 01 1 9 01 1 021 1 023 1 025 1 027 C C T 1 029 1 031 G T 1 033 C C 1 035 G C C 1 037 T 1 039 以圖 為例訊號不穩(wěn)部分發(fā)生在定序開始跟結(jié)束的地方。圖 為一個訊號穩(wěn)定的例子 G 2357 A T A G C A G G A A G A T G T G G A G T G T T T G C G G A G T C T G A T Fr agment E1 2_T7 0 G 300 A T A G C A G G A 309 A G 31 0 31 1 A T 31 31 2 3 G T 31 4 31 5 G 31 6 G 31 7 A 31 8 G 31 9 T 320 G T T T G C 325 326 G G A G T C T G 334 A T 335 336 301 302 303 304 305 306 307 308 321 322 323 324 327 328 329 330 331 332 333 以圖 范例而言，訊號極為穩(wěn)定，其峰值相當尖且單純。 在串接時候每個串接序列的重迭區(qū)域序列如果不相符合的話， Contig 的窗口 在 中圖片的下方綠色線部分會呈現(xiàn)凹陷(圖 )；下方序列也會將不符合的部分標示 出來：圖 不符合的重迭區(qū)域位在綠色線凹陷的地方 ，修改的第一步要先觀察重迭區(qū)域的訊號，用戶可以在下方序列窗口中點 選序列后按下鼠標右鍵(圖 )：圖 先觀察區(qū)域重迭的部份，將其訊號打開做調(diào)整 使用者可以選擇 打開所有訊號：圖 打開所有的訊號 打開訊號或是 ，而下方訊號則是非常的不穩(wěn) 定。因此可采用上方的序列修改。 若要關(guān)掉訊號只要按下鼠標右鍵再點選 就可以將訊號關(guān)掉。 進行序列修正時首先要點選窗口左上方的 ，或是 后才能進行修改的操作。最快速 的修改方法是直接采用正確的序列，使用者首先點選不采用的序列，接著按下鼠標 右鍵后選擇 Reference Sequence：圖 利用 Reference Sequence 修正 使用此功能后，重迭的部分就會完全采用上方窗口的序列(圖 )： ，因其有較好的峰值 第二種方式是使用拖曳或是反轉(zhuǎn)，將序列拖曳或反轉(zhuǎn)將不相符合的區(qū)段進行修 正， 此種問題大部分出自于程序做 overlap 運算時， 所采取的運算方法不兼容所造成。 在拖曳或是反轉(zhuǎn)前同樣要先按下 才能操作，要進行拖曳時先將鼠標點選到欲拖 曳的序列后按住 Ctrl 鍵不放就可以進行鼠標拖曳(圖 )：圖 利用拖曳或反轉(zhuǎn)進行修正 拖曳好以后放開鼠標就可以改變位置并觀察重迭情形(圖 )： 。此外要進行比較細部的 移動時可以用上方的 個前進或后退； 做細部移動，按下 可以指定移動的距離：圖 拖曳范圍的設(shè)定 或是 可以讓序列一個一 如果要把序列反轉(zhuǎn)只要按下上方 就可反轉(zhuǎn)序列了： (圖 )， 一樣要先按下 。 用 戶可以直接在最下面 Contig 文字序列的部分進行序列編輯， 首先把要修改的部分用 鼠標選取：圖 選取要修改的部分，直接輸入修改的內(nèi)容 選取的部分可以用鍵盤直接打字進行修改或者按 Delete 鍵刪除： ，代表已刪