【正文】 最快速 的修改方法是直接采用正確的序列，使用者首先點(diǎn)選不采用的序列，接著按下鼠標(biāo) 右鍵后選擇 Reference Sequence：圖 利用 Reference Sequence 修正 使用此功能后，重迭的部分就會完全采用上方窗口的序列(圖 )： ，因其有較好的峰值 第二種方式是使用拖曳或是反轉(zhuǎn)，將序列拖曳或反轉(zhuǎn)將不相符合的區(qū)段進(jìn)行修 正， 此種問題大部分出自于程序做 overlap 運(yùn)算時， 所采取的運(yùn)算方法不兼容所造成。 圖片下面是整個接起來的全長， 紅色網(wǎng)格線區(qū)域則是串接迭合（overlap）的部分。 使用ContigExpress將小片段序列串接 將小片段的序列串接成完整大片段序列的方式如下之操作過程。 只要用鼠標(biāo)點(diǎn)選圓圈的部分，就會在右邊的窗口顯示該部分： ，對應(yīng)到左下窗口的紅點(diǎn) 若要編輯 block 可以點(diǎn)選欲修改的部分后， 按下鼠標(biāo)右鍵選擇 Edit block 或是 點(diǎn)選主程序上方 (圖 )：圖 編輯或修改相似的區(qū)域，點(diǎn)選 Edit block 在編輯的窗口下，用戶可以在下方為此 block 命名及修改顏色(圖 )，在 左上方使用者可以選擇比對的序列。 　 AlignX Blocks AlignX Blocks 可以用在蛋白質(zhì)序列比對，和 AlignX 不同的地方在于比對的 序列會以圖形表示比對的結(jié)果。 例如用在 RNA 序列可以預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域。 Import /Export MSF： 序列比對的檔案可以 MSF 的格式輸出(圖 )，此格式的檔案可以用其他的序 ，也可將既有的 MSF 格式的檔案輸入到 AlignX，程序就 會自動比對。想要更改顏色跟 Consensus 的設(shè)定只要從程序上方選取 View→Display Setup 進(jìn)入設(shè)定畫面：圖 設(shè)定序列片段不同顏色 如此用戶就可以根據(jù)自己的喜好來設(shè)定顯示的條件。以圖 為例，使用者可以看到 Guide tree 將 ABC 和斑馬魚海大基因歸為同 一群，這表示 ABC 和斑馬魚海大基因是具有比較親近的關(guān)系。 　 如何開始進(jìn)行序列比對？用戶可以從程序集開啟檔案(圖 )：圖 由程序集開啟 AlignX 　　　 　 或者是從主程序中開啟(圖 )：圖 由主程序開啟 AlignX 　 用戶也可以在主程序(圖 )具有操作序列的情況下開啟 AlignXAlign Selected Molecules，使用者的序列會直接加載到 AlignX 中：圖 在操作序列的情況下開啟 AlignX 的方法 　 開啟 AlignX 之后，使用者會見到圖 的畫面：圖 在操作序列的情況下開啟 AlignX 首先用戶要把序列加載 Vector NTI 程序中，可以點(diǎn)選 或者從左上方的 Project →Add Files 把序列檔案加載，請注意文件名不可以過長，檔名過長會造成程序進(jìn)行比 對時無法完全顯示文件名(圖 )：圖 輸入的檔名注意不可過長 　 選取檔案后按下開啟就可以加載程序中， 若比對的序列很多時可以用鼠標(biāo)圈選欲 分析的序列后選擇開啟。上方是使用者的序列，下面是比對的序列。圖 可以編輯比對的調(diào)整 圖 如有選擇 PSI、PHI 才能對其做調(diào)整 (Basic Local Alignment Search Tool) 圖 如有選擇 MEGABLAST 才能對其做調(diào)整 注意 PSI、PHI 和 MEGABLAST 的設(shè)定要在該項(xiàng)目之下才能進(jìn)行調(diào)整。請參照轉(zhuǎn)譯功能中 6 Frame Translation 部分。 Long PCR：這項(xiàng)功能將在分析 genomic DNA 再說明。 Hairpin Loops 的狀況 　 在這個窗口中， 實(shí)線數(shù)目的相關(guān)設(shè)定是在 Oligo Analysis 左邊字段下方的 Stem Length 項(xiàng)目（此數(shù)值關(guān)乎 dimer 跟 hairpin Loop 分析的嚴(yán)謹(jǐn)度，建議數(shù)值調(diào)高跟調(diào) 低的結(jié)果都進(jìn)行分析） 。 中間 Maximum Number of Output Options 可以設(shè)定引子組數(shù)， 下面的參數(shù)是可以設(shè) 計(jì)引子的特性，如 Tm 值及引子長度等等。 點(diǎn)選 ：圖 使用內(nèi)建的序列和限制酶，建立屬于自己的 Marker 　 選擇序列數(shù)據(jù)和限制酶之后點(diǎn)選 Save as Gel Marker 即可儲存在 Local Database 中。 （也可用 Camera 指令復(fù)制到別的檔案） 　 Restriction Report(圖 )：這個選項(xiàng)可以把所有限制酶對序列剪切的結(jié)果進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)，這份表格同樣可以進(jìn)行打印、儲存和復(fù)制：圖 將所有限制酶對序列剪切的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 　 假設(shè)海大頂尖中心研發(fā)出一個限制酶 TsjI，其辨認(rèn)剪切的序列是目前市上所 沒有的，若要放入 Vector NTI 軟件進(jìn)行分析，用戶需先進(jìn)入到 Local Database 里 面點(diǎn)選左上角的 Enzymes 選項(xiàng)(圖 )：圖 選取 Enzymes 選項(xiàng)，將新的限制酶加入數(shù)據(jù)庫 　 接下和建立序列資料的作法一樣，使用者可以制作一個新的限制酶的檔案 (圖 )：圖 制作新的限制酶檔案 (圖 )：圖 設(shè)定限制酶的辨認(rèn)序列和切點(diǎn) 按下確定就可建立好限制酶的數(shù)據(jù)(圖 )，用戶可以針對此限制酶進(jìn)行分析：圖 建好的限制酶資料結(jié)果 NOTE：限制酶的辨認(rèn)序列除了 A、T、C、G 之外還有其他字母，這些字母分別 代表： R = A or G Y = T or C　 W = A or T S = G or C M = A or C K = G or T　 H = A or T or C　 B = C or T or G V = A or C or G　 D = A or G or T　 N = A or C or G or T 　電泳膠片分析　 Vector NTI 可以將使用者的基因序列放在一個模擬的膠片中，并且模擬電泳 選項(xiàng)后會出現(xiàn)下列窗口(圖 )：圖 模擬電泳圖分析設(shè)定 圖分析的結(jié)果。 ://　限制酶切位分析在 NTI 主程序中， 用戶可以針對序列的限制酶切位和切割后的片段進(jìn)行分析 (圖 )。 　 另一種作法是將欲轉(zhuǎn)譯的序列選取后， 進(jìn)入上方 Analyses→Translation(圖 ) 功能進(jìn)行轉(zhuǎn)譯：圖 利用 Analyses→Translation，將 DNA 序列轉(zhuǎn)成胺基酸 　 在進(jìn)行轉(zhuǎn)譯之前，使用者可以針對特定的物種設(shè)定轉(zhuǎn)譯的密碼，主程序的密 碼設(shè)定為一般標(biāo)準(zhǔn)的密碼，我可以進(jìn)入 Set Genetic Code(圖 )來更改密碼：圖 利用 Genetic code 更改轉(zhuǎn)譯密碼 ，用戶若要進(jìn)行密碼編輯時(圖 )，可以按下 NEW 這個按鈕進(jìn)行編輯：圖 選取海大斑馬魚密碼進(jìn)行編輯 　 　 決定好密碼后，用戶即可使用 Analyses→Translation→Into New Protein 來進(jìn)行圖 利用 Direct Strand 來進(jìn)行序列正股轉(zhuǎn)譯 序列轉(zhuǎn)譯的功能： 　 其中 Direct Strand(圖 )是將 DNA 序列進(jìn)行正股轉(zhuǎn)譯；Complementary Strand 是將序列的互補(bǔ)股進(jìn)行轉(zhuǎn)譯；而 6 Frame Translation 是將正股和互補(bǔ)股各從起使 第一、第二和第三的位置進(jìn)行轉(zhuǎn)譯，所以會有六個胺基酸序列數(shù)據(jù)產(chǎn)生(圖 )：圖 進(jìn)行 DNA 序列正股轉(zhuǎn)譯后的結(jié)果 　 執(zhí)行這三個指令后程序會產(chǎn)生一個新的窗口(若采用 6 Frame Translation 功能 則會產(chǎn)生六個)，在程序執(zhí)行轉(zhuǎn)譯功能前會跳出一個建立序列的窗口(圖 )，用 戶可以在此窗口命名和進(jìn)行相關(guān)的批注，也可以將此序列檔案存放在 Local Database 的特定位置：圖 序列轉(zhuǎn)譯之前的命名及批注編輯 　 完成之后按確定就會出現(xiàn)序列轉(zhuǎn)譯后的結(jié)果(圖 )：圖 序列轉(zhuǎn)譯后的結(jié)果 　 進(jìn)行轉(zhuǎn)譯功能后所產(chǎn)生的窗口，其界面的操作方式跟原本的窗口完全相同， 我們可以進(jìn)行序列編輯、繪圖以及數(shù)據(jù)輸出，在文字窗口的 Analysis 項(xiàng)目可以看 到本程序?qū)D(zhuǎn)譯出蛋白質(zhì)序列的相關(guān)批注。圖 Properties 文字編輯的結(jié)果 　 在最旁邊有個回形針的按鈕(圖 )，點(diǎn)選之后可以輸入相關(guān)的文字作為批 注。 視圖譜大小和形狀： 可以檢 能夠改變圖形的形狀，把序列變成圓形或是直線， 圓形的圖形適用于表現(xiàn)質(zhì)體序列的形狀；直線適用于表現(xiàn)單一股序列形狀。 　 除此之外，我們可以在鼠標(biāo)右鍵出現(xiàn)的指令中點(diǎn)選 Reverse selection 可以將 我們選取的序列轉(zhuǎn)變成為此序列的互補(bǔ)股(圖 )：圖 點(diǎn)選 Reverse Selection 產(chǎn)生序列的互補(bǔ)股 　 Vector NTI 還有在原有的序列中刪除或是插入另一段序列的功能，想要在原 來的序列中插入另一段序列時，先將光標(biāo)移動到想要插入的位置后，在上方 Edit 項(xiàng)目中選擇 New→Insert Sequence at * bp，*表示插入的位置，圖 中是以第 14 個 bp 的位置進(jìn)行說明： 　 此時我們就可以插入新的序列， 并可以用手動輸入或是復(fù)制貼上的方式進(jìn)行 序列編輯(圖 )：圖 編輯插入的新序列 　 按下 OK 就可以把序列插入(圖 )： ，選取該區(qū)段后按下圖 選取所要刪除的序列片段部份 按鈕： 　 按下確定就可以將該區(qū)段刪除(圖 )。圖 修改序列背景、字號和顏色 　 圖 是將其中一段的文字背景改成紫色，另一段的文字顏色改成紅色。 　接口基本操作本章介紹序列窗口和文字窗口的基本操作指令。 　 接著按 OK 后再按確定(圖 )，如此便建立好我們的序列數(shù)據(jù)了。 NTI 的程序中會有一個內(nèi)建好的數(shù)據(jù)庫， 在 同時把 存盤的路徑預(yù)先設(shè)定在數(shù)據(jù)庫的位置之中。圖 Vector NTI 主程序及附屬程序 各別開啟 主程序開啟 ，點(diǎn)選 OK。 請下載下面這個檔案進(jìn)行安裝 ，變更為自服務(wù)器取得授權(quán)的方式： →程序集→Invitrogen→Vector NTI Advance 10→License Manager(圖 )。圖 授權(quán)設(shè)定 Applications 頁面中(圖 )，點(diǎn)選下面的 Dynamic 按鈕，上面四個字段請?zhí)?上使用者的姓名，系所單位，電話和電子郵件位置，最下面一欄 URL of DLS 請入以 下字符串： :8080/。這樣DNA molecules， proteins， enzymes， oligos，and gel markers 將組成NTI 的 數(shù)據(jù)庫，并出現(xiàn)下列三個窗口()。我們自身主機(jī)的數(shù)據(jù)庫叫做 Local Database，同時 NTI 提供了數(shù)據(jù)庫分享的功能，可以透過網(wǎng)絡(luò)和其他主機(jī)交換或 分享序列數(shù)據(jù)。之后要開 啟此數(shù)據(jù)時，只要進(jìn)入 Local Database 后，在自己建立的文件夾下連續(xù)點(diǎn)兩下該 文件名就可以直接開啟。 現(xiàn)在我們已經(jīng)將斑馬魚的基 因序列加載主程序中，接下來要如何處理文字和序列的編輯呢？ 匯入序列后將出現(xiàn)如圖 畫面：圖 一般接口操作指令 　 注意在紅色框線的那一排是窗口的一般操作指令，隨著光標(biāo)所在位置的不 這三個指令，分別代表著三 同，窗口所出現(xiàn)的指令也會不同。學(xué) 會了文字編輯后，接下來我們發(fā)現(xiàn)序列的排列似乎不是很美觀，想要改變序列的 排列方式可以在序列窗口狀態(tài)下點(diǎn)鼠標(biāo)右鍵進(jìn)入 Display setup，或是點(diǎn) 這時會出現(xiàn)下面指令(圖 )：圖 檢視工具 按鈕 　 點(diǎn)選 Sequence setup 項(xiàng)目后會出現(xiàn)： 　 我們可以在這個序列檢視工具 (圖 )之下設(shè)定各種的排列方式，底下的序 列窗口為一個預(yù)覽窗口，會依我們的設(shè)定而變動，將設(shè)定調(diào)整好后按 OK 就可以 了，如此一來就可以有一個整齊美觀的序列呈現(xiàn)在我們面前。在主程序 Edit 項(xiàng)目下 Cut 和 Delete 這兩個指令也可以執(zhí)行刪除序列，操作方法同上。圖譜 大小用 來放大縮小圖片，可以依照個人喜好調(diào)整。所輸入的文字也可以進(jìn)行相關(guān)的調(diào)整： 圖 為圖形增加文字批注 　 按下 OK 就會顯示在圖譜窗口上(圖 )， 所輸入的文字批注也會在文字窗口 中出現(xiàn)。 　 Feature(圖 )：這個選項(xiàng)的功能和上述功能很接近，差別只是在于用戶可 以利用此功能直接轉(zhuǎn)譯序列中的某特定區(qū)段， 只要把光標(biāo)點(diǎn)選欲分析的區(qū)塊就可 以執(zhí)行此功能：圖 利用 Feature 工具，可以直接轉(zhuǎn)譯序列中所選取的部分 　　 CDS with Splicing：這個項(xiàng)目將在日后進(jìn)行 Intron、Exon 分析時再進(jìn)行更進(jìn) 一步的說明。在主程序中，開啟上方 Analysis 選項(xiàng)進(jìn)入 Restriction Analysis：圖 限制酶切位和切割后的片段分析 　 在 Restriction Sites 的選項(xiàng)中用戶可以設(shè)定欲分析的限制酶：圖 利用 Restriction Sites 選項(xiàng)設(shè)定欲分析的限制酶 　 在窗口的左邊是程序默認(rèn)的限制酶(圖 )，欲進(jìn)行調(diào)整可以點(diǎn)選 Remove 或 是 Remove All 移除。點(diǎn)選 　 此窗口中用戶可以設(shè)定電泳的條件，例如電泳片的大小、種類、電壓、緩沖 液等；在左下角的 View Parameters 選項(xiàng)可以設(shè)定電泳運(yùn)作的時間。 　 Add to Gel Sample List：這一項(xiàng)功能可以將用戶欲分析的電泳片段存取在一 個程序內(nèi)建的數(shù)據(jù)窗口，用戶可以利用此窗口進(jìn)行快速存取，接口十分友善。若要在引子兩端加入限制酶剪切序列 可以點(diǎn)選 ：圖 Find PCR Primers 進(jìn)階設(shè)定，在引子兩端可加入限制酶剪切序列 　 使用者可以在下方 Attach to 5’terminus(圖 )點(diǎn)選 加入欲設(shè)定的限制酶 即可；上方 UserDefined Primers 的項(xiàng)目可以把在 Local Database 中現(xiàn)有的引子資 料直接使用。 　 NOTE： 在做引子設(shè)計(jì)的時候盡量減少 dimer 和 hairpin Loop 的產(chǎn)生， 因?yàn)?dimer 和 hairpin Loop 會降低使用者 PCR 的效率。 Multiplex PCR List：和 Add to Oligo List 功能差不多，只是直接把欲分析引子的序 列加入暫存窗口內(nèi)進(jìn)行引子分析的功能(圖 )：圖 使用 Multiplex PCR List 分析的結(jié)果 ：此功能將在多重序列比對的部分再進(jìn)行說明。； ） tblastn 是指將使用者的胺基酸序列反轉(zhuǎn)譯成為核酸序列后再去和 NCBI 的核酸數(shù)據(jù)庫做比對，注 意這個項(xiàng)目之下會因 6 Frame Transla