【正文】 此外要進行比較細部的 移動時可以用上方的 個前進或后退； 做細部移動，按下 可以指定移動的距離：圖 拖曳范圍的設定 或是 可以讓序列一個一 如果要把序列反轉只要按下上方 就可反轉序列了： (圖 )， 一樣要先按下 。 若要關掉訊號只要按下鼠標右鍵再點選 就可以將訊號關掉。 串接好的序列大部分會出現(xiàn)序號干擾的問題，此問題在于定序的訊號在定序開 始和結束的時候會特別不穩(wěn)定，這些不穩(wěn)定的部分大都會造成序列判斷的錯誤，用 戶首先需先了解訊號圖譜可以相信的部分，此部分的訊號峰值相當尖且單純；訊號 不穩(wěn)定的部分峰值平緩且有許多噪聲重迭： ，較為平緩的訊號較容易判斷錯誤 C C 2357 T G T T C C G A C C C T G C C G C T T A A C A G G A T A C C T G T C C G C C T Fr agment E1 2_T7 0 C C 999 T 1 001 G T T 1 003 C C G A C C C 1 005 1 007 1 009 1 1 01 T G 1 3 01 C C 1 5 01 G C T T A A C A G G A T A 1 7 01 1 9 01 1 021 1 023 1 025 1 027 C C T 1 029 1 031 G T 1 033 C C 1 035 G C C 1 037 T 1 039 以圖 為例訊號不穩(wěn)部分發(fā)生在定序開始跟結束的地方。如果只想看單一個堿基的 訊號可以用上方的 按鈕關掉不想讓系統(tǒng)顯示的訊號：圖 判讀單一個堿基 圖 為關掉 T 和 G 訊號后的范例。 一般序列的文本文件格式都可以加入程序中，而含有定序訊號的序列檔案一般 都為 abi 的文件格式，如果沒有相關的程序是無法讀取進行分析，而 ContigExpress 可以讀取和分析這種類型的檔案。 　 序列串接　 使用Vector NTI中的ContigExpress程序()可利用序列相似度，將小片段序 列進行串連。 ，只要按下 OK 就會依使用者的需求展示比對 圖譜，圖 是把其中一個 block 命名為 JST，顏色改成黃綠色：圖 將其中一組 block 命名為 JST，并將顏色改成黃綠色 (圖 )：圖 以不同的顏色代表不同的 block 如果想要把蛋白質序列中的 block 放在同一直列觀察，可以將特定的 block 點選后下按 或是從 Blocks→Link 將各序列的 block 放在同一列(圖 )：圖 將各序列的 block 放在同一列中觀察 。圖 更改 Score matrix 的參數(shù)， →Search for blocks 程序進行運算， 經(jīng)運算完成之后會出現(xiàn)下面的畫面：圖 運算的結果：左下為相似的區(qū)域，右上為序列的圖形顯示，右下為比對的畫面 在左下的窗口(圖 )中所顯示的是程序依照蛋白質序列和設定的參數(shù)所比 對出相似的區(qū)域，此區(qū)域稱之為 block； 右上方的窗口是把比對的序列以圖形顯示， 可以判別 block 之間的位置關系； 右下方則是序列的比對畫面。可點選 是從 Blocks→AlignX Blocks Setup 進行調整：圖 參數(shù)的設定會影響程序的運算，要適當?shù)恼{整得到所要的結果 或 參數(shù)的設定會影響到程序的運算，并造成不同的比對結果。進行 Dot Matrix 功能時，用戶必須調整此兩數(shù)值到最佳狀態(tài)，才會 得到最佳的結果， 下列幾個圖形范例(圖 )， 是用不同的數(shù)值所表現(xiàn)出不同的分 析結果：圖 Stringency=1，Window=1 圖 Stringency=1，Window=10 ，Window=10 圖 Stringency=40，Window=1 ： 在 NTI 主程序中選取 Analyses→Primer design→Alignment PCR List 時會出現(xiàn)一個 Alignment PCR 窗口(圖 )于主程序下方：圖 使用 Alignment PCR List 比對 選擇 Add 或是 Load 把要比對的序列檔案加載(圖 )：圖 點選 Add 或 Load 載入比對的序列 (圖 )：圖 執(zhí)行比對，會開啟 AlignX 的窗口 接著進行序列比對(圖 )：圖 進行序列比對 在比對的序列部分選取好要 PCR 的范圍按下鼠標右鍵點選 Design PCR Primers (圖 )： ，進行 Primer 的設計 這時就會出現(xiàn) Primer 設計的頁面(圖 )：圖 設定 Primer 的結果 接下來就依照自己的需求設計 Primer，注意在 Amplicon Length Min 的項目不可以 設定比選取的范圍長。選好兩組序列后，程序會繪制出比對結果(圖 )：圖 兩個序列比對后的結果 比對結果(圖 )可以用鼠標左鍵拖曳放大直到看的清楚為止： ； 則是可以用來畫網(wǎng)格線進行比對(圖 )： 圖 增加網(wǎng)格線的比對結果 一開始使用 Dot Matrix Plot 比對出來的序列并不正確，使用者必須調整兩項參數(shù) ，可以按下 或是從上方 Matrix→Matrix Setup 做調整： 圖 Stringency 越小越嚴謹，Window 越大圖形越長 窗口(圖 )中有兩個項目會影響分析的結果，一個是 Stringency。 想要調整序列比對的計算條件跟參數(shù)可以從 更改(圖 )： 或是 Align→Alignment Setup 進行 圖 使用 Alignment Setup，調整序列比對的計算條件跟參數(shù) ，除非對 Alignment 的計算方式有特殊需 求，在此不建議擅自更改任何參數(shù)和設定。 Identity Table： 從程序上方 Align→Show Identity Table 用戶可以看到一個表(圖 )：圖 使用 Identity Table 作序列的比較 這個圖表將各序列之間的 Identity 做了一個整理，只要交叉對照就可以知道序列 之間的 Identity， 其單位為百分比。圖 以每 100 個 nucleotide 換行做輸出 　 另外一種輸出的方式是使用打印功能(圖 )， 用戶可以按下鼠標右鍵選擇 Print Preview， 在打印預覽畫面中程序會詢問是否選擇顯示 Consensus Sequence， 確定后按下 OK：圖 使用打印的方式輸出 ：圖 在打印的選項中，選擇 Adobe PDF 輸出電子圖 在打印機的選項(圖 )選擇用 Adobe PDF 或者是其他形式， 按下確定就可以輸 出成電子圖文件，如此一來就可以一次將全部比對的結果輸出，并兼顧到畫面美觀。只要將光標 移到排列的結果上方，按下鼠標右鍵選擇 Edit Alignment，或者從上方從程序上方選 View→Edit Alignment 進入：圖 手動排列比對 用戶只要利用鼠標反白標記想要移動的序列區(qū)段后， 就可以使用下方的綠色箭頭 按鈕進行前后移動(圖 )：圖 選取要編輯設定區(qū)塊 ，點選最下方的選項插入 Gap 進行調整(圖 )：圖 點選最下方的選項插入 Gap 進行調整 調整完畢后按下 OK 鍵或者是 Apply 鍵就完成重新排比，如下圖所示，圖 是調整前的結果，圖 則是調整后的結果：圖 調整前的結果 圖 調整后的結果 序列排列的前后順序可以手動移動， 將要移動的序列用鼠標點選拖曳就可進行移 動(圖 )：圖 選取序列利用拖曳方式進行移動 (圖 )，可以點選序列后按鼠標右鍵，選擇 第二個項目后按確定移除： 圖 選擇 Remove 移除序列 如果想要加入其他序列進行重新比對，可以將欲加入的序列反白，接著點選 或者從 Align→Add Selected To Alignment 將序列加入比對(圖 )：圖 選擇 Add Selected To Alignment 增加序列 想要將某一序列從程序中完全移除的話可以將序列反白后， 按鼠標右鍵選擇第二個項 目：圖 將序列從程序中完全移除，選擇 Delete ，可以先點鼠標右鍵后，選擇 Camera(圖 )：圖 利用 Camera 將序列輸出 在這個 Camera 選項中，F(xiàn)ormat 有兩種格式可以選擇，第一個是 Metafile，選擇此 格式序列會以圖形文件的形式輸出， 注意 Metafile 不會一次輸出全部的序列比對結果， 只會輸出屏幕中顯示的部分（有點像 Print Screen 的快照功能） ，想要將所有比對輸出 必須多次的使用 Metafile 輸出，圖 是使用兩次 Metafile 格式輸出的結果，第一次 輸出序列 1 到 109，第二次是 110 到 218：圖 使用兩次 Metafile 格式輸出的結果 ，用戶可以在 Range 的項目中選擇所有比對的結果，或 者是輸出特定的比對區(qū)域。 如果要進行演化樹的分析必須使用其相關軟件， NTI 不支持畫演化樹的功 能。數(shù)值越大長度 就會越長。把光標移到圖形上方按 下鼠標右鍵點選 Plot Setup：圖 設定圖形表示的方式 用戶就可以根據(jù)自己的喜好設定圖形的表示方式(圖 )： 　 圖形要進行輸出的時候，只要把光標移到圖形上方，按下鼠標右鍵選擇 Camera 就可以復制圖形到其他檔案中。右邊 的圖形則是表示序列比對的計算分數(shù)和分布范圍的關系。 ） ，右 ） ，檔案可以直接點選開啟，接口的使 第十章 多重序列比對 第十章 多重序列比對 　 Vector NTI 的多重序列比對程序和其他的比對軟件比較起來非常的方便實用，操 作接口也很簡單，比對的結果可以存取和輸出。圖 箭頭表示比對的方向，箭頭越長黃色區(qū)域越大，表示比對到的區(qū)域越多 圖 箭頭較短，比對到的區(qū)域相對于圖 ，比對到區(qū)域的較少 由圖 可以得知圖 比對出來的區(qū)域比圖 來的多。由此圖形可以得知用戶的序列在 800bp 前后的區(qū)域有最佳的比對結果；分數(shù)最高分的 區(qū)塊座落在 600bp 到 800bp 的部分，可以推測此區(qū)域可能扮演了重要的功能性。 把 BLAST 分析的項目點選打開后會出現(xiàn)類似主程序的畫面(圖 )：圖 直接打開之前 BLAST 分析的檔案，不需重新再次操作 BLAST ，分割成三個窗口，上面偏左的文件夾是文字敘述的窗口(圖 )，提供使 用者 BLAST 搜尋的設定條件和比對到的數(shù)據(jù)，用戶可以打開這些文件夾獲得更進一步的信息：圖 文字窗口，提供用戶設定條件與比對到的數(shù)據(jù) 用戶可以點選畫藍色底線的選項(圖 )，就會自動連上 NCBI 把相關的數(shù)據(jù)截取加載主程序中：圖 選擇藍色底線的部份，將直接連到 NCBI 下載相關數(shù)據(jù) (Basic Local Alignment Search Tool) 此時主程序的數(shù)據(jù)就是來自于 NCBI GeneBank 的數(shù)據(jù)(圖 )：圖 由 NCBI GenBank 下載得到的數(shù)據(jù) 用戶可以在比對到的結果上，按下鼠標右鍵后，選擇 Save Selected Hits 存入數(shù)據(jù)庫中(圖 )：圖 選擇 Save Selected Hits，將數(shù)據(jù)存入數(shù)據(jù)庫中 ，上方的序列是使用者的序列；下方的序 列是數(shù)據(jù)庫中比到的序列，注意在 BLAST 程序中只會顯示比對到的區(qū)域，不會顯示序列的全長。 數(shù)據(jù)庫的說明請見附錄。 Tblastx 的部分是指將使用者的核酸序列用 6 Frame Translation 進行轉譯后的蛋白質序列（總共有 六種不同序列）和 NCBI 的核酸數(shù)據(jù)庫進行 6 Frame Translation 后的 蛋白質序列做比對。圖 進入 BLAST 的程序，出現(xiàn)兩個區(qū)塊，上方區(qū)塊輸入序列，下方區(qū)塊為顯示分析結果 序列的輸入很簡單，使用者只要把想要分析的序列復制貼上至此區(qū)塊就可以了(圖 )。 Sequencing Primers：這項功能可以幫用戶設計定序時所需的引子，在窗口 (圖 )中設定想要設計的條件：圖 幫助使用者設計定序時所需之引子 設好條件之后只要按 OK 就會顯示引子數(shù)據(jù)，后續(xù)操作方式和 Find PCR Primers 相同：圖 利用 Sequencing Primers 分析的結果 Hybridization Probes：此功能適用于設計核酸探針(圖 )，能夠用在南方墨 點、北方墨點及定位雜交等實驗探針設計： ，可設計核酸探針 設定好條件后按下 OK 就會顯示探針數(shù)據(jù)， 后續(xù)操作方式和 Find PCR Primers 相同：圖 使用 Hybridization Probes，顯示探針數(shù)據(jù) NOTE：引子設計的條件和注意事項請參考相關的設定說明。 ： 此功能和 Find PCR Primers 也是幾乎一樣， 但是分析的范圍設定 在使用者有畫在圖譜上面 Features 的部分，注意要執(zhí)行此功能時，用戶事先畫好 的 Features 名稱必須要和 提供的名稱一樣才能執(zhí)行。 　 用戶可以在分析的窗口窗口(圖 )進行手動編輯，只要打入序列就可以分 析使用者編輯的序列，但是請注意不可以有空格存在：圖 在右邊字段直接輸入序列，分析輸入的序列 　 使用者也可以把現(xiàn)有的引子序列， 利用鼠標復制貼上的功能將序列貼進來分 析。要開啟 Oligo List 時，使用者只要點選 即可(圖 )： 圖 開啟 Oligo List，對引子進行編輯和分析 (圖 )。以海大斑馬魚基因為例子，設計一個兩端帶有 EcoRI 和 NdeI 的限 制酶片段、Tm 值介于 55 到 60、GC 含量介于 50 到 60、長度介于 20 到 欲夾 的序列全長及引子數(shù)目，設定好相關條件后按下確定(圖 )： ”確定” 　 這時用戶在文字窗口(圖 )的下方字段可以看到多出一個 PCR Analysis 的文圖 文字窗口，增加了 PCR Analysis 的數(shù)據(jù) 件夾，上面會顯示用戶設計的引子數(shù)據(jù)： 　 在這個字段中使用者首先看到序列會被一個空格切成兩部分(圖 藍色部 分)，左邊的序列為使用者加入限制酶的序列；右邊的序列為設計的引子序列。 可以將設計好的引 子進行存取和分析，也可以將設計好的引子資料傳送 Invitrogen 進行引子合成。 用戶可以利用鼠標選取欲分析之序列后，點選 按下 ，結果如圖 ：圖 使用 Add to Gel Sample List，來進行快速存取 選項，接著在電泳的操作窗口 　 選取使用者欲加入電泳片的 sample， 再點選 選項就可以加入膠片中 （畫 面(圖 )上膠片為選取第 7 個