【正文】 第一部分 HIV1 Tat(3861)融合蛋白的表達(dá)及免疫原性分析Digested with BamHI and HindⅢ圖 12 PET32Tat(3861)原核表達(dá)、純化及免疫學(xué)分析流程圖PCR 擴(kuò)增轉(zhuǎn)化 BL21SDS－PAGE大量表達(dá)純化ELISA 鑒定兔抗 PEPTIDETat(1101)血清鑒定 HIV1 陽性血清鑒定HIV1 Tat（3861）DNA 99bpTA 克隆第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一部分 HIV1 Tat(3861)融合蛋白的表達(dá)及免疫原性分析151. 實(shí)驗(yàn)材料 儀器儀器名稱 型號 生產(chǎn)廠家臺式天平 JA61001 上海天平儀器廠電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械五廠多用途恒溫振蕩器 DDHZ300 江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠紫外與可見分析裝置 FR200 復(fù)日科技臺式低速離心機(jī) KA1000 上海安亭科學(xué)儀器廠高壓滅菌鍋 YXQSG4128V 上海醫(yī)用核子儀器廠CO2 恒溫培養(yǎng)箱 BB5060 Hetaeus/(德國)梯度 PCR 儀 Mastercycler gradient Eppendorf/(德國)小型臺式離心機(jī) 5415D Eppendorf/(德國)可調(diào)式加樣器 5000/1000/200/40/10μL Finnpipette/(芬蘭)電泳儀 Power Pac200 BioRad/(美國)電泳槽 MiniPROTEAN II BioRad/(美國)微型電泳槽 H61 上海精益有機(jī)玻璃儀器廠臺式 pH 計(jì) 868 奧立龍公司微型混合器 H92 上海康達(dá)電子儀器廠通用酶標(biāo)儀 ELX800 BioTek/(美國)磁力攪拌器 Jan95 上海司樂儀器廠脫色搖床 STS1 上海奇特分析儀器廠 試劑試劑名稱 生產(chǎn)廠家氯化鈉(NaCl) 上?；瘜W(xué)試劑有限公司試劑四廠氯化鉀(KCl) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司氫氧化鈉(NaOH) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司葡萄糖(Glucose) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一部分 HIV1 Tat(3861)融合蛋白的表達(dá)及免疫原性分析無水磷酸氫二鈉(Na 2HPO4) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司無水磷酸二氫鉀(KH 2PO4) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司碳酸鈉(Na 2CO3) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司碳酸氫鈉(NaHCO 3) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司乙二胺四乙酸(EDTA) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司氯化鈣(CaCl 2?2H2O) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司冰乙酸(CH 3COOH) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司鹽酸(HCl) 上海振興化工一廠乙醇(Ethyl Alcohol) 上海振興化工一廠吐溫20（Tween20 ） 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司TritonX100 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司瓊脂粉(Agar) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司瓊脂糖(Agarose) 上海愛紫特科技有限公司酵母抽提物(Yeast Extract) OXOID胰蛋白胨(Tryptone) OXOID丙烯酰胺(Acrylamide) BBI迭氮鈉(NaN 3) BBI考馬斯亮蘭(Coomassie Brilliant Blue) Fluck過硫酸銨(Ammonium Presulfate) Amresco溴化乙錠(Ethidum Bromide) Amresco鹽酸四環(huán)素(Tet) Amresco氨芐青霉素(Ampicillin，Amp) Amresco硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate，Kan) Amresco十二烷基硫酸鈉(SDS) Amresco甘油(glycerol) Amresco異丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG) Merck四甲基聯(lián)苯胺(TMB) Merck TAKARA限制性內(nèi)切酶（BamH I 和 Hind Ⅲ） TAKARA第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一部分 HIV1 Tat(3861)融合蛋白的表達(dá)及免疫原性分析17pMD18T Vector TAKARA熱啟動 Taq DNA 聚合酶 上海申能博彩生物科技有限公司質(zhì)粒抽提試劑盒 上海申能博彩生物科技有限公司PCR 小量膠回收試劑盒 北京天根生物科技有限公司T4 DNA 連接酶（Ligation High kit） TOYOBO 公司金屬鰲合親和層析介質(zhì)（NiNTA） 德國 QIAGEN 公司12 份 HIV1 感染者血清10 份鮮血員血清羊抗人 IgGHRP兔抗 Tat(1101)PEPTIDE 血清羊抗兔 IgGHRP上海公共衛(wèi)生中心上海長海醫(yī)院華美生物公司本室制備華美生物公司 實(shí)驗(yàn)配制溶液? 50TAE 電泳緩沖液：Tris ，冰醋酸 ， EDTA() 20ml，加無菌雙蒸水至 100ml，室溫保存。? 10mg/ml 溴化乙錠：溴化乙錠 溶解于 20ml 無菌雙蒸水中，4℃避光保存。? 氯化鈣：CaCl 2?2H2O 溶解于 100ml 無菌雙蒸水中，121℃高壓滅菌，4℃保存。? PBS(～)：137mM NaCl， KCl， Na2HPO4， KH2PO4，4℃保存。? 80%甘油：80mL 甘油加無菌雙蒸水至 100ml，混合均勻，121℃高壓滅菌，室溫保存。? 100mg/ml 青霉素溶液：Amp 1g 溶解于 10ml 無菌雙蒸水中，過濾除菌， 20℃保存。? 15mg/ml 卡那霉素溶液：Kana 溶解于 10ml 無菌雙蒸水中，過濾除菌，20℃保存。? SolutionⅠ (SⅠ)：50 mM 葡萄糖() ，25 mM TrisHcl ()，10 mM EDTA ()，無菌雙蒸水定容至 100ml，調(diào) PH 值至 ，105℃高壓滅菌，4℃保存。? SolutionⅡ (SⅡ)：10M NaOH 20μl，10％SDS 100μl，無菌雙蒸水 880μl，現(xiàn)配現(xiàn)用。第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一部分 HIV1 Tat(3861)融合蛋白的表達(dá)及免疫原性分析? SolutionⅢ (SⅢ)：5M 乙酸鉀()， 冰乙酸，無菌雙蒸水定容至100ml，121℃高壓滅菌，4℃保存。 培養(yǎng)基? LB 液體培養(yǎng)基：1% Tryptone，% yeast extract，1% NaCl，以去離子水溶解，121℃高壓滅菌，4℃保存。? LB 固體培養(yǎng)基：1% Tryptone，% yeast extract，1% NaCl， 瓊脂粉，以去離子水溶解，121℃高壓滅菌，冷卻至 80℃后加入 1/1000 抗性，混合均勻后立即鋪平板，4℃保存?zhèn)溆谩? 2YT：% Tryptone，% yeast extract，% NaCl，以去離子水溶解，121℃高壓滅菌，4℃保存。 菌株、質(zhì)粒和蛋白? 菌株：大腸桿菌（）DH5α 、BL21(DE3) 由第二軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室保存。? 質(zhì)粒：pMD18T 購自 TAKARA 公司；pET32a 由第二軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室保存。 HIV1 tat（3861）區(qū)段確定及引物設(shè)計(jì) HIV1 tat（3861）擴(kuò)增區(qū)段確定根據(jù) Tat 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)將其序列分為五個功能區(qū)段，Tat（3861）將包含其中的 3844961 兩個功能區(qū)段，見圖 13。 HIV1 tat（3861）引物設(shè)計(jì)根據(jù) HIV1 株 Tat 氨基酸序列（ GenBank：）以及大腸桿菌偏好密圖 13 tat（3861）功能區(qū)段 Tat 3861aa第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一部分 HIV1 Tat(3861)融合蛋白的表達(dá)及免疫原性分析19碼子，設(shè)計(jì) 2 條引物，委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。引物采用 軟件分析評價，5’端引入 BamHI 酶切位點(diǎn)，3’端引入 Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。構(gòu)建 HIV1 株 tat(3861)的引物序列見表 11。 pET32a(+)表達(dá)載體圖譜 pET32a(+)表達(dá)載體大小為 5900bp，根據(jù)其序列（圖 14） ，選擇 BamHI 和HindⅢ兩個克隆位點(diǎn)，用于目的片段 tat(3861)的插入。 TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTT TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGC…315bp…CTGGCCGGTTCTGGTTCTGGC M* S 105aa…. L A G S G S G CATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAA H M H H H H H H S S G L V P A G S G M L GAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGAC G T A A A L P G A G H M A S P A L G T A GACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGC A A A L A M A A I G S G P G L A A G A C GGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAA G A T A A P P P P P L A S G C End pET32a(+) 克 隆 及 表 達(dá) 區(qū) T7 promoter Lac operator Xba ITrx?TagHis?TagS?TagNco I EcoR Ⅴ BamH I EcoR I Sac I Sal INot I His?Tag注：*蛋白從起始密碼子 ATG 開始翻譯，空載體蛋白的表達(dá)至 TAA 結(jié)束，融合蛋白的表達(dá)至 TGA 結(jié)束圖 14 表達(dá)質(zhì)粒 pET32a(+)的分子結(jié)構(gòu)示意圖DescriptionSequences Names of primersU38 and D61 were used to amplify tat3861,U38 contained BamHI restriction sites (underlined).. D61 contained HindⅢ restriction sites (underlined)U38 539。 AGA GGA TCC TTCATCACCAAAGCTCT339。 D61 539。 CCCTCGAGTAAGCTTCTAGTTCTGGTG AGCACGA339。表 11 用于擴(kuò)增 HIV1 tat(3861) 的引物第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一部分 HIV1 Tat(3861)融合蛋白的表達(dá)及免疫原性分析2. 實(shí)驗(yàn)方法 HIV1 tat(3861)的合成、克隆及序列測定 重疊延伸 PCR 的方法制備 HIV1 tat(3861)合成 tat(3861)：應(yīng)用 PCR 方法分別體外合成 HIV1 tat3861。模板為pMD18Ttat 質(zhì)粒 10ng，引物為 U38，D61；反應(yīng)條件為： 94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 40s，共 30 個循環(huán)； 72℃延伸 10min。使用北京天根生物科技有限公司的瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收 PCR 產(chǎn)物，詳細(xì)操作按說明書進(jìn)行，PCR 回收產(chǎn)物以 %瓊脂糖電泳檢測，與 DL2022 DNA marker 對比分析片段大小。 PCR 產(chǎn)物與 pMD18T 載體連接 取純化后的 tat(3861) PCR 產(chǎn)物與 pMD18T 載體按摩爾比 1:1 的比例連接，詳細(xì)操作按說明書進(jìn)行，16℃連接 16h。 感受態(tài)細(xì)胞的制備 原始菌 DH5α 劃線 LB 平皿,37℃溫箱中培養(yǎng)過夜，挑取活化平皿上 DH5α 單克隆菌落接種于 2mlPsi 培養(yǎng)基的試管中，37℃，250rpm 振蕩培養(yǎng)過夜；菌液 1/100 轉(zhuǎn)接于 Psi 培養(yǎng)基中，37℃ ，250rpm 搖蕩培養(yǎng)至 OD 值 ；將菌液 1ml/支，分裝于 ml 離心管中，冰水浴 25min；4℃，4000rpm 離心 10min；去除上清，收集菌體，并用 1ml CaCl2 小心將細(xì)胞懸浮起來；冰水浴 15min，4℃，4000rpm 離心10min；去除上清，沉淀用 200μl CaCl2 將細(xì)胞小心復(fù)懸，冰浴備用。 轉(zhuǎn)化 將連接產(chǎn)物 pMD18T tat(3861)，200ng 加入 200μl 感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰水浴 30min；42℃水浴熱沖擊 90s；冰水浴 2min；加 800μl 2YT 培養(yǎng)基，37℃，160 rpm，振蕩培養(yǎng) 1h；取 100μl 均勻涂布 LB（Amp）平皿；放入 37℃ 溫箱中，正向放置 1h 以吸收過多的液體，然后倒置