【正文】 麥效果不穩(wěn)定，有時還有負效果。 適當?shù)念A處理可以顯著提高花藥的愈傷組織誘導率。常用的預處理方法是低溫冷藏，具體的處理溫度和時間長度因物種而異：煙草7～9℃，7～14 d；水稻7～1O℃，10～15 d；黑麥1～3℃，7～14 d；大麥3～7℃，7～14 d。但低溫預處理對小麥效果不穩(wěn)定，有時還有負效果。 消毒花藥適宜培養(yǎng)時，花蕾尚未開放，花藥在花被或穎片的嚴密包被之中，本身處于無菌狀態(tài)，因此，通常只要以70% 酒精噴灑或擦拭花器或包被著麥穗的葉鞘表面，即可達到滅菌要求。接種把雄蕊上的花藥輕輕地從花絲上摘下，水平地放在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，在整個操作過程中不應使花藥受到損傷，若受損傷，則應淘汰，因為損傷常常會刺激花藥壁形成二倍體愈傷組織。 如果所碰到的是花器很小的植物，如天門冬屬、蕓苔屬和三葉草屬植物等，可能需要借助解剖鏡夾取花藥，或是只把花被去掉，把花蕾的其余部分連同其中原封未動的雄蕊一起接種在培養(yǎng)基上 .由于花藥對離體培養(yǎng)的反應存在“密度效應”，因此每個容器中接種的花藥數(shù)量不宜太少，以形成一個合理的群體密度。 培養(yǎng)方式1) 在瓊脂固化培養(yǎng)基表面培養(yǎng)。2) 在加人30％Ficoll的液體培養(yǎng)基表面飄浮培養(yǎng)。3) 利用固體一液體雙層培養(yǎng)基培養(yǎng)，以便既能保持較高的接種密度，培養(yǎng)基又不易失水干涸。培養(yǎng)條件對于大多數(shù)小麥品種來說，在培養(yǎng)的最初6d給以30～32 ℃的較高溫度，然后再轉(zhuǎn)入28～30℃下培養(yǎng)，花藥出愈率會有明顯提高。水稻花藥培養(yǎng)的適宜溫度從一開始就是27℃。 對光照的要求在物種間差異更為明顯，例如連續(xù)光照可顯著增加煙草花粉胚的產(chǎn)量，卻強烈抑制曼陀羅的花粉胚胎發(fā)生。禾谷類植物在花粉愈傷組織誘導期間則以暗培養(yǎng)或散射光培養(yǎng)效果較好，強光會抑制小麥花粉愈傷組織的形成。 愈傷組織的分化原則上都應在光照下進行，但對光照強度和照光時間的要求則因物種而異。例如水稻花粉愈傷組織在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基之初仍不宜照光培養(yǎng)，須待3～5d后再給以每天14h 1000～2 000lx的光照，以免引起愈傷組織的老化壞死。對小麥花粉植株則不宜給以長日照。 壯苗和移栽以小麥為例，王培等采用的方法是：將已長出2～3片葉的花粉植株轉(zhuǎn)入含有多效唑3 mg／L，NAA和KT各O．5 mg／L，LH500mg／L和蔗糖8％的MS培養(yǎng)基上，于22～25℃下進行壯苗培養(yǎng)，然后在3～8 ℃低溫弱光條件下越夏，深秋時煉苗移栽。 單倍體植株的二倍化單倍體植株能正常地生長到開花期，但由于缺少同源染色體，減數(shù)分裂不能正常進行，因而不能形成有活力的配子。秋水仙素處理誘導染色體加倍 (1)禾本科植物，一般都是在分蘗盛期用秋水仙素溶液浸泡分蘗節(jié)，% 秋水仙素處理8h，水稻，％的秋水仙素處理24h。為了增強處理效果，溶液內(nèi)皆須加人1％～2％的助滲劑二甲基亞砜(DMSO)。 (2)把含有秋水仙素的羊毛脂涂于上部葉片的腋芽上，然后把主莖的頂芽去掉，以刺激側(cè)芽長成二倍體的可育枝條。（3）采用愈傷組織和試管苗染色體加倍。％秋水仙素溶液中96h（煙草），然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上使其進一步生長。三、影響雄核發(fā)育的因子雄核發(fā)育指小孢子沿孢子體途徑發(fā)育成花粉植株的過程。 1 基因型 陳錦驊等(1982)報道，水稻不同種、亞種和品種間花藥對離體培養(yǎng)反應的高低順序是：糯粳粳／秈秈／秈秈。在粳稻中花粉愈傷組織誘導率平均可達10％，而在秈粳中只有1 %～2％。2 生理狀態(tài) 幼年植株的花藥反應能力較好，在開花末季采集的花藥不但形成孢子體的頻率很低，而且發(fā)生反應的時間也較遲。在水稻和小麥等禾谷類植物中，大田植株比溫室植株、主莖穗比分蘗穗花粉愈傷組織的誘導率高 王敬駒等(1974)看到，在水稻中若在10℃下用乙烯利預處理植株84h，可增加花藥對培養(yǎng)的反應能力。 3 花粉發(fā)育時期一般而言單核后期花藥對培養(yǎng)反應較好，但不同物種最適的發(fā)育時期不同 。例如，在毛曼陀羅、煙草中，最適時期是在花粉第一次有絲分裂的當時或稍前稍后。而在顛茄和林生煙草中以雙細胞早期最好，在金氏煙草中雙細胞早期則是絕對必要。很多禾本科植物的花藥是在單核早期(大麥)或單核中、晚期反應最好。 檢查花粉發(fā)育時期常用的方法是醋酸洋紅染色，但對于DNA含量較低的材料，最好用孚爾根試劑染色。此外，對水稻和玉米等植物而言，IKI染色效果比醋酸洋紅更好. 4 藥壁因子在花粉胚發(fā)育過程中花藥壁起著重要的作用?；ㄋ帉ν晃锓N及不同物種離體花粉雄核發(fā)育有看護作用。甚至花藥浸提液也能刺激花粉胚的形成。在大麥花藥漂浮培養(yǎng)中，若使用曾經(jīng)培養(yǎng)過大麥花藥或子房7d的條件培養(yǎng)基，能顯著促進花粉胚的形成。在曼陀羅離體小孢子培養(yǎng)中，用谷氨酰胺、絲氨酸和肌醇三者一起可以取代藥壁因子的作用，而在煙草花粉培養(yǎng)中，只用谷氨酰胺即能取代這種作用。5 培養(yǎng)基（1） 基本培養(yǎng)基MS，Miller和Nitsch培養(yǎng)基等對花藥培養(yǎng)普遍適用。N6培養(yǎng)基(朱至清等，1974)適用于稻、麥和玉米，C17培養(yǎng)基(王培等，1986)適用于小麥 ， N C17提高了禾谷類植物花粉形成愈傷組織和愈傷組織分化綠苗的頻率。(2) 碳源最常用的碳源是蔗糖。麥芽糖、果糖和葡萄糖也取得了良好的培養(yǎng)效果。由于不同植物花粉細胞的滲透壓不同，對蔗糖濃度的要求也不同。此外，花粉細胞的滲透壓通常高于花絲等體細胞的滲透壓，因此所用的蔗糖濃度最好能在不妨礙花粉細胞增殖的同時，又能抑制體細胞的增殖。 煙草、油菜、甜椒和柑橘等蔗糖濃度為3％，水稻3％～6 %，小麥6％～10 %，大麥和黑麥草12％，玉米12％～15％。 （3）植物激素花藥在離體培養(yǎng)中對激素的要求有2種不同的情況：煙草、毛曼陀羅等雄核發(fā)育的途徑是直接形成花粉胚。一般不需要激素，在基本培養(yǎng)基上就可以產(chǎn)生完整的單倍體植株。在大多數(shù)已知能進行雄核發(fā)育的非茄科物種中，花粉粒首先形成愈傷組織，然后，由愈傷組織分化出孢子體。在這些植物中，為了誘導花藥進行雄核發(fā)育，必須單獨地或以不同配比在培養(yǎng)基中加入生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、復雜的營養(yǎng)混合物(如酵母浸出液，水解酪蛋白)和椰子汁等。在大多數(shù)禾本科植物如水稻、小麥、大麥的花藥培養(yǎng)中，外源生長素，特別是2，4一D(13 mg／L)，是啟動小孢子細胞分裂形成愈傷組織的必要條件。（4）活性炭在煙草花藥培養(yǎng)基中添加1％活性炭，％活性炭，都能大幅度提高花粉植株的形成頻率 .四、禾谷類植物花藥培養(yǎng)中白化苗的形成在大麥、小麥和水稻的花粉植株中，白化苗通常要占總苗數(shù)的1／3以上，嚴重的情況下，例如在大麥品種Sabarlis的花粉植株中白化苗頻率可高達60％～90％。在水稻中造成白化的原因是由于前質(zhì)體不能正常地發(fā)育成葉綠體，既不能形成基粒又完全缺乏核糖體。現(xiàn)只知道白化苗的形成受溫度的影響，當溫度由26℃增加到35℃時，白化苗的數(shù)目也隨之增加。Genovesi等(1979)在水稻上還觀察到，花粉處在單核期的花藥若在10℃和13 ℃下冷處理3～14 d，所產(chǎn)生的植株中有90％是綠苗。然而，無論在10℃或13 ℃下，若把冷處理的時間延長到21 d，所產(chǎn)生的植株幾乎全是白化苗，花粉處在雙核期的花藥比處在單核期的花藥產(chǎn)生的白化苗較多。除葡萄外，在禾本科以外植物的花藥培養(yǎng)中未曾發(fā)現(xiàn)過白化苗 。五、離體花粉培養(yǎng)花藥培養(yǎng)存在的問題 由于一個花藥內(nèi)的花粉粒在遺傳上是異質(zhì)的，因此，由一 個花藥所產(chǎn)生的植株，將構成一個異質(zhì)的群體。單倍體植株若是經(jīng)由花粉愈傷組織的途徑產(chǎn)生的，由于從若干花粉起源的愈傷組織常?；煸谝黄穑虼擞梢粋€花藥形成的愈傷組織將會是一個嵌合體。 在花粉愈傷組織化的同時，花藥壁細胞也進行增殖，最終所得到的愈傷組織就不可能具有純粹的配子體起源 。Tulecke（1953年）報道了裸子植物花粉離體培養(yǎng)形成愈傷組織。 Kameya和Hinata(1970)報道甘藍和甘藍芥藍雜種的成熟花粉離體培養(yǎng)形成愈傷組織。培養(yǎng)方法為懸滴培養(yǎng)法。為了防止花粉破裂，在4℃下的低溫中接種，在20℃下暗培養(yǎng)。 Sharp等(1972)用看護培養(yǎng)法培養(yǎng)番茄的離體花粉粒，也成功地獲得了單倍體細胞的無性繁殖系 。第十一章 細 胞 培 養(yǎng)? 1902年，Haberlandt提出了植物細胞全能性概念，認為植物細胞具有再生成為完整植株的潛在全能性，首次提出分離植物單細胞,并將其培養(yǎng)成植株的設想。1954年，Muir首次成功地進行了植物細胞的懸浮培養(yǎng)。? 20世紀80年代以來植物細胞培養(yǎng)技術迅速發(fā)展，已經(jīng)成為生物工程研究開發(fā)的新熱點。迄今為止，已經(jīng)獲得400多種植物的細胞，不僅可以通過細胞的再分化生成完整的植株，而且可以通過細胞培養(yǎng)獲得600多種人們所需的各種物質(zhì)。細胞培養(yǎng)的意義? 植物細胞培養(yǎng)可用于生產(chǎn)色素、藥物、香精、酶等次生代謝物。細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物具有提高產(chǎn)率、縮短周期、提高產(chǎn)品質(zhì)量等顯著特點，且不占用耕地，不受地理環(huán)境和氣候條件等的影響，對于農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)具有深遠的意義。? 通過單細胞的克隆化，可以把微生物遺傳學技術用于高等植物，以進行農(nóng)作物的改良。一、植物細胞的獲取? （一）由完整的植物器官分離單細胞? 機械法： ? （1）先撕去葉表皮，使葉肉細胞暴露，再用小解剖刀把細胞刮下來。這些離體細胞可直接在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。? （2）先把葉片輕輕研碎，然后再通過過濾和離心把細胞凈化。 ? 優(yōu)點：①細胞不至受到酶的傷害作用；②無需質(zhì)壁分離? 酶解法? Takebe等人(1968)最早報道，在煙草中通過果膠酶處理,大量分離具有代謝活性的葉肉細胞。在用酶解法分離細胞的時候，必須對細胞給予滲透壓保護。（二） 通過愈傷組織誘導獲取植物細胞把未分化的和易散碎的愈傷組織轉(zhuǎn)移到裝有30～50 ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在25C177。1 ℃，弱光或黑暗中，將三角瓶置于搖床上不斷振蕩(120 r／min)。初期每10 d左右用新鮮培養(yǎng)液更換掉三角瓶中大約4／5的舊液.二、植物細胞培養(yǎng)的方法? 按照培養(yǎng)基條件分為? 固體培養(yǎng)：指細胞在含有瓊脂的固體培養(yǎng)基上生長繁殖的培養(yǎng)過程。固體培養(yǎng)在細胞和小細胞團的篩選、誘變，原生質(zhì)體培養(yǎng)等方面廣泛使用。? 液體培養(yǎng)：又分為液體薄層靜止培養(yǎng)和液體懸浮培養(yǎng)等。? 按照培養(yǎng)對象的不同可分為? 愈傷組織培養(yǎng)、單細胞培養(yǎng)、單倍體細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、固定化細胞培養(yǎng)、小細胞團培養(yǎng)等。（一） 液體懸浮培養(yǎng) 分批培養(yǎng)容器一般是100～250 ml三角瓶，每瓶中裝有20～75 ml培養(yǎng)基。為了使分批培養(yǎng)的細胞能不斷增殖，必須進行繼代。方法是取出培養(yǎng)瓶中一小部分懸浮液，轉(zhuǎn)移到成分相同的新鮮培養(yǎng)基中(大約稀釋5倍)。在分批培養(yǎng)中，細胞數(shù)目增長的變化表現(xiàn)為一條S形曲線。分批培養(yǎng)是當今植物懸浮培養(yǎng)最常用的方式，但是分批培養(yǎng)方式的生產(chǎn)周期較長，設備利用率較低。 連續(xù)培養(yǎng) 封閉型連續(xù)培養(yǎng)：排出的舊培養(yǎng)基由加入的新培養(yǎng)基進行補充，進出數(shù)量保持平衡。懸浮在排出液中的細胞經(jīng)機械方法收集起來之后，又被放回到培養(yǎng)系統(tǒng)中。因此，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)目不斷增加。開放型連續(xù)培養(yǎng) ：注入的新鮮培養(yǎng)液的容積與流出的原有培養(yǎng)液容積相等，并通過調(diào)節(jié)流入與流出的速度，使培養(yǎng)物的生長速度永遠保持在一個接近最高值的恒定水平上?？煞譃閮煞N主要方式：一是化學恒定式；二是濁度恒定式。 半連續(xù)培養(yǎng) 在培養(yǎng)過程中，每隔一段時間從反應器中放出部分培養(yǎng)液，并補充部分新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方式。半連續(xù)培養(yǎng)可以提高設備利用率，可以適當提高單位體積反應器的產(chǎn)量。但在添加新鮮培養(yǎng)基的時候，要注意防止微生物的污染。 （二）單細胞培養(yǎng)平板培養(yǎng)法 將含有游離細胞和細胞團的懸浮培養(yǎng)物過濾，棄去大的細胞團，留下游離細胞和小細胞團。把與液體培養(yǎng)基成分相同但加入 ％～1%瓊脂的培養(yǎng)基加熱，使瓊脂融化，然后冷卻到35℃，將培養(yǎng)基和細胞懸浮培養(yǎng)液等量混合，迅速注入并使之鋪展在培養(yǎng)皿中。 看護培養(yǎng)法 最初是由Muir等人(1954)設計的。把單個細胞置于一塊活躍生長的愈傷組織上進行培養(yǎng)，在愈傷組織和培養(yǎng)的細胞之間，有一片濾紙相隔。愈傷組織和所要培養(yǎng)的細胞可以屬于同一個物種，也可以是不同的物種。 微室培養(yǎng)法 由Jones等人(1960)設計 。主要優(yōu)點是在培養(yǎng)過程中可以連續(xù)進行顯微觀察，把一個細胞的生長、分裂和形成細胞團的全部過程記錄下來。 4．條件培養(yǎng)法 條件培養(yǎng)基是指含有植物細胞培養(yǎng)上清液或靜止細胞的培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)是將單細胞接種于條件培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，使單細胞生長繁殖。 基本過程如下植物細胞培養(yǎng)上清液或靜止細胞懸浮液的配制 先將群體細胞或者細胞團接種于液體培養(yǎng)基中進行細胞懸浮培養(yǎng) ，將培養(yǎng)液移入離心管中進行離心分離，分別得到植物細胞培養(yǎng)上清液和細胞沉淀。細胞沉淀在60℃條件下處理30 min，得到?jīng)]有生長繁殖能力的細胞，即為靜止細胞。將靜止細胞懸浮于一定量的無菌水中，得到靜止細胞懸浮液。條件培養(yǎng)基的配制 將植物細胞培養(yǎng)上清液或者靜止細胞懸浮液與50℃％瓊脂的固體培養(yǎng)基混合均勻。接種：a 將一小片濾紙置于條件培養(yǎng)基上，再在濾紙上方接種單細胞；b 將單細胞直接接種于條件培養(yǎng)基的表面；c 在配制條件培養(yǎng)基時，取一定量的單細胞懸浮液一起加入，混勻而成。d 先配制好條件培養(yǎng)基，待其凝固后，再在條件培養(yǎng)基的上面鋪上一層含有單細胞的固體培養(yǎng)基。(三) 固定化細胞培養(yǎng) 固定化細胞指固定在載體上、在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞。1979年，Brodelius等人開創(chuàng)了植物細胞固定化的研究。與植物浮培養(yǎng)比較，固定化植物細胞具有穩(wěn)定性好、產(chǎn)物容易分離、利于連續(xù)化生產(chǎn)等特點。但是只適用于可以分泌到細胞外的次級代謝物生產(chǎn)。 植物細胞固定化的方法 （1）吸附法 ：將植物細胞吸附在多孔的陶瓷、玻璃、塑料大孔隙或裂縫之中，也可將植物細胞吸附在中空纖維的外壁。優(yōu)點：操作簡便易行，對細胞的生長、繁殖和新陳代謝沒有明顯的影響。缺點：吸附力較弱，吸附不牢固，細胞容易脫落。 （2）包埋法