【正文】 環(huán)水式真空泵 SHBⅢ 鄭州長城科工貿(mào)有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE52C 上海亞榮生化儀器廠 恒溫水浴鍋 W2100S 上海申生科技有限公司電子分析天平 FA2022 上海精科天平紫外光分光光度計(jì) UV752N 上海精密科技儀器有限公司架盤藥物天平 HC?TP1113?5 北京醫(yī)用天平廠超聲清洗器 KQ118 昆山市超聲儀器有限公司移液管 北京玻璃儀器廠 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑表 2 實(shí)驗(yàn)所用藥品與試劑種類 純度 生產(chǎn)廠家刺玫果 吉林市豐滿區(qū)小白山鄉(xiāng)無水蘆丁 標(biāo)準(zhǔn)品 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)鑒定無水乙醇 分析純 天津市大茂化學(xué)試劑廠氫氧化鈉 分析純 天津市大茂化學(xué)試劑廠亞硝酸鈉 分析純 天津市大茂化學(xué)試劑廠硝酸鋁 分析純 上海試劑四廠 實(shí)驗(yàn)原理和方法 實(shí)驗(yàn)原理黃酮類化合物在植物組織中，多以甙的形式存在，也可為甙元形式存在。對(duì)黃酮甙元來說，宜用極性較小的溶劑，如乙醚、氯仿、醋酸乙酯等進(jìn)行提取，對(duì)于含較多非極性基團(tuán)的甙元，則可用氯仿或苯提取，如陳皮素（5，6，7，8，3180。，4180。六甲氧基黃酮）。黃酮甙類及極性較大的甙元，一般可采用甲醇、乙醇、水及丙酮、含水醋酸乙酯等加熱提取，或利用甲（乙）醇水（一定比例，如 2：1，3：1 等）系統(tǒng)提取。這樣，不僅易于提出黃酮素，而且易于濃縮除醇，有利于進(jìn)行下一步的萃取、沉淀等分離操作，同時(shí)，60~80%的乙醇可破壞植物組織中共存酶的活性，以防黃酮甙的酶解。17 / 46大孔樹脂吸附的原理是根據(jù)類似物吸附類似物的原則，一般非極性樹脂宜于從極性溶劑中吸附非極性有機(jī)物質(zhì)，相反強(qiáng)極性樹脂宜于從非極性溶劑中吸附極性溶質(zhì)，而中等極性吸附樹脂，不但能從非水介質(zhì)中吸附極性物質(zhì)，也能從極性溶液中吸附非極性物質(zhì)。 實(shí)驗(yàn)方法1．紫外分光光度（UV）法黃酮類物質(zhì)是以 2苯基并吡喃酮為母核的多羥基化合物，可與糖苷類物質(zhì)遇堿變成明顯黃色，其機(jī)制是黃酮類物質(zhì)在堿性條件下其苯吡喃酮的 1，2 碳之間的 CO 鍵打開成查耳酮的檢測方法，常用分光光度計(jì)法或液相色譜法。分光光度法以用黃酮與鋁離子在堿性與亞硝酸存在條件下形成黃酮的鋁絡(luò)合物，生成穩(wěn)定的黃色。紫外分光光度(UV)法的原理是根據(jù)黃酮類物質(zhì)與鋁離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，并產(chǎn)生特征吸收光譜而進(jìn)行測定。2．大孔樹脂吸附法大孔吸附樹脂是一種具有大孔結(jié)構(gòu)的有機(jī)高分子共聚體，是一類人工合成的有機(jī)高聚物吸附劑。因其具多孔性結(jié)構(gòu)而具篩選性，又通過表面吸附、表面電性或形成氫鍵而具吸附性。一般為球形顆粒狀，粒度多為 2060 目。大孔樹脂有非極性（HPD100,HPD300,D101,X5,H103）、弱極性（AB8，DA201,HPD400）、極性（NKA9,S8,HPD500）之分。大孔吸附樹脂理化性質(zhì)穩(wěn)定，一般不溶于酸堿及有機(jī)溶媒，在水和有機(jī)溶劑中可以吸收溶劑而膨脹。大孔吸附樹脂技術(shù)以大孔吸附樹脂為吸附劑，利用其對(duì)不同成分的選擇性吸附和篩選作用，通過選用適宜的吸附和解吸條件借以分離、提純某一或某一類有機(jī)化合物的技術(shù)。該技術(shù)多用于工業(yè)廢水的處理、維生素和抗生素的提純、化學(xué)制品的脫色、醫(yī)院臨床化驗(yàn)和中草藥化學(xué)成分的研究。它具有吸附快，解吸率高、吸附容量大、洗脫率高、樹脂再生簡便等優(yōu)點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)步驟及實(shí)驗(yàn)流程圖 實(shí)驗(yàn)步驟 大孔吸附樹脂法純化玫果總黃酮實(shí)驗(yàn)步驟：（1）乙醇提取刺玫果粗粉，過濾備用。（2）刺玫果總黃酮含量測定的研究。（3）樹脂預(yù)處理。（4）樹脂的靜態(tài)及動(dòng)態(tài)吸附解吸測定。（5）最佳工藝條件的選擇及驗(yàn)證。（6）樹脂的重復(fù)性使用。 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線 大孔樹脂法純化刺玫果總黃酮實(shí)驗(yàn)流程圖18 / 46 → → → → → → → → 圖 1 大孔樹脂法實(shí)驗(yàn)流程圖 實(shí)驗(yàn)操作部分 方法學(xué)研究(1)對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在120℃減壓于燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20mg，置100mL量瓶中，加60％乙醇適量。超聲使溶解．放冷并稀釋至刻度，搖勻,即得（） 。(2)供試品溶液的制備 取本品，研細(xì)，取刺玫果粗粉 10g，用 6 倍量 75%乙醇溶液，提取 3 次，提取時(shí)間每次 5 小時(shí)，趁熱過濾，離心，減壓濃縮，置 100ml 容量瓶中，用 75%的乙醇稀釋至刻度，搖勻即得。(3)測定法 精密量取供試品溶液 2ml，置 50ml 容量瓶中，加入 60%的乙醇 10ml，搖勻，精密加入 5%的亞硝酸鈉溶液 1ml，搖勻，放置 6 分鐘，加入 10%的硝酸鋁溶液 1ml，搖勻，放置6 分鐘，加入 4%的氫氧化鈉溶液 10ml，然后加入 60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置 10分鐘，測定吸收度。(1)檢測波長的選擇取蘆丁對(duì)照品溶液、供試品溶液及蒸餾水（配制空白溶液）各 5ml，分別置于 50ml容量瓶中各加 60%乙醇 10ml，搖勻，精密加入 5%亞硝酸鈉溶液 1ml，搖勻，放置 6 分鐘，加 10%硝酸鋁溶液 1ml，搖勻，放置 6 分鐘，加 4%氫氧化鈉溶液 10ml，然后加 60%乙醇稀釋至 50ml，搖勻，放置 10 分鐘。照分光光度法，在 400600nm 之間，以 2nm 為一個(gè)單位進(jìn)行光譜掃描.樹脂的預(yù)處理 對(duì)照品溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制測定洗脫劑濃度的選擇提取物純度測定pH 值選擇流速選擇上樣濃度選擇19 / 46表 3 供試品掃描波長結(jié)果表波長 吸光度 波長 吸光度 波長 吸光度 波長 吸光度40040240440640841041241441641842042242442642843043243443643844044244444644845045245445645846046246446646847047247447647848048248458648849049249449649850050250450650851051251451651852052252452652853053253453653854054254454654855055255455455655856056256456656857057257457657858058258458658859059259459659860020 / 46表 4 對(duì)照品掃描波長結(jié)果表 波長 吸光度 波長 吸光度 波長 吸光度 波長 吸光度4004024044064084104124144164184204224244264284304324344364384404424444464484504524544564584604624644664684704724744764784804824845864884904924944964985005020226504506508510512514516518520522524526528530532534536538540542544546548550552554556558560562564566568570572574576578580582584586588590592594596598600由上兩表可知,得蘆丁的最大吸收波長為 508nm，供試品在 508nm 有最大吸收峰，因此本方法能作為刺玫果中總黃酮的測定方法。所以選取 508nm 為測定波長。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取對(duì)照品溶液 、、 于 50ml 容量瓶中，加 60%乙醇 10ml，搖勻，精密加入 5%的亞硝酸鈉溶液 1ml，搖勻，放置 6 分鐘，加入 10%的硝酸鋁溶液 1ml，搖勻，放置 6 分鐘，加入 4%的氫氧化鈉溶液 10ml，然后加入 60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置 10 分鐘，以試劑作空白，在 508nm 波長處測吸光度。得到的數(shù)據(jù)如下：表 5 線性關(guān)系考察C（mg/ml） 21 / 46A 0．084 0．170 以濃度 C 為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行直線回歸，得回歸方程：y=－，R=，結(jié)果表明蘆丁在 性關(guān)系。圖 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(3)穩(wěn)定性考察取刺玫果粗粉 10g，用 6 倍量 75%乙醇溶液，提取 3 次，提取時(shí)間每次 5 小時(shí)，趁熱過濾，離心，減壓濃縮，置 100ml 容量瓶中，用 75%的乙醇稀釋至刻度，搖勻即得供試品溶液，將供試品溶液稀釋 5 倍，取 2ml 定容至 50ml 容量瓶中，按供試品測定方法，每隔一定時(shí)間測定同一供試品溶液在不同時(shí)間的吸光度。數(shù)據(jù)為：表 6 穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)測定時(shí)間（min）0 15 30 45 60吸光度值（A） RSD(%) 結(jié)果表明：RSD 值 %%，樣品在 60 分鐘內(nèi)吸光度基本不變。(4)精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液 12ml 于 50ml 容量瓶中，加 60%乙醇 10ml，搖勻，精密加入 5%的亞硝酸鈉溶液 1ml，搖勻，放置 6 分鐘，加入 10%的硝酸鋁溶液 1ml，搖勻，放置 6 分鐘，加入 4%的氫氧化鈉溶液 10ml，然后加入 60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置 10 分鐘，以試劑作空白，在 508nm 波長處測吸光度。連續(xù)測定 5 次，其 RSD 值為 ，表明儀器精密度良好。各份樣品數(shù)據(jù)如下：22 / 46表 7 精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)測定次數(shù) 1 2 3 4 5吸光度值 RSD（%） 結(jié)果表明：RSD 值 %，儀器精密度良好。(5)重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批刺玫果粉 5 份，每份 10g，按供試品溶液制備方法制備 5 份供試品溶液，每份取供試品溶液 10ml，置 50ml 容量瓶中，加 60%乙醇 10ml，搖勻，精密加入 5%的亞硝酸鈉溶液 1ml，搖勻，放置 6 分鐘，加入 10%的硝酸鋁溶液 1ml，搖勻，放置 6 分鐘，加入 4%的氫氧化鈉溶液 10ml，然后加入 60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置 10 分鐘，以試劑作空白，在 508nm 波長處測吸光度。數(shù)據(jù)如下：表 8 重現(xiàn)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)測定次數(shù) 1 2 3 4 5吸光度(A) RSD（%） 結(jié)果表明：RSD 值 %%，本方法重現(xiàn)性符合要求。 大孔樹脂法純化刺玫果總黃酮的工藝研究1．樹脂的預(yù)處理取經(jīng)篩選后的各樹脂，先用 95％乙醇連續(xù)洗滌數(shù)次約兩 2h，至流出液加水不渾濁為止,然后用蒸餾水洗至無醇味；然后用 5%HC1 溶液浸泡 4h 后以 46BV/h 的流速洗滌 2h，而后用蒸餾水洗至出水 pH 值為中性；再用 2%的 NaOH 溶液浸泡 6h，而后用蒸餾水水洗至pH 值中性，濾去水室溫晾干即得。2．樹脂的裝柱濕法裝柱：將稱量好的樹脂倒入燒杯中，加適量蒸餾水?dāng)噭?。向洗干凈的玻璃柱中加入脫脂棉，將其放到玻璃柱的底部，然后將已預(yù)先處理好的樹脂緩緩倒入玻璃柱中，如果有氣泡可用吸耳球輕輕敲擊玻璃柱，直至氣泡全部跑出為止，由玻璃柱下端放出多余的水分。樹脂裝好柱后，就可以進(jìn)行藥液吸附了。但在藥液倒入樹脂柱時(shí)，會(huì)沖起表面的樹脂顆粒，使樹脂柱表面形成凹形，藥液經(jīng)過樹脂柱時(shí)產(chǎn)生偏流與渦流。影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這時(shí)最好在樹脂柱表面放一層脫脂棉，又能對(duì)藥液起過濾作用，又可減緩藥液對(duì)樹脂柱的沖力。23 / 46 大孔樹脂的靜態(tài)吸附及解吸供試品溶液的制備：取刺玫果粗粉 10g，用 8 倍量 80%乙醇溶液，提取 3 次，提取時(shí)間每次 2 小時(shí)，趁熱過濾，離心，減壓濃縮，置 500ml 容量瓶中，用 80%的乙醇稀釋至刻度，搖勻即得供試品藥液。1．樹脂的靜態(tài)吸附