transwell實(shí)驗(yàn)原理與步驟-資料下載頁
2025-06-25 07:32本頁面
【正文】 我們將其置于盛有自來水的燒杯中,反復(fù)漂洗幾次,將多余蘇木素洗去再行脫水、透明。這樣做出的細(xì)胞圖片背景干凈,細(xì)胞清楚。四唑鹽試驗(yàn)（MTT）比色試驗(yàn)四唑鹽是一種能接受氫原子的染料，簡稱MTT?；罴?xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長處測(cè)定其光吸收值，可間接反映細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。 MTT溶液：稱取250mgMTT，放入小燒杯中，加50ml培養(yǎng)液或平衡鹽溶液在電磁力攪拌機(jī)上攪拌30min，5mg/ml。，分裝，4℃保存?zhèn)溆?，兩周?nèi)有效。操作步驟1. 接種細(xì)胞：%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103～104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul。2. 培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。（培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?. 呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，37℃孵箱中繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液(對(duì)于懸浮生長的細(xì)胞，需離心1000rpm，5min)。每孔加入150ul DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。4. 比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為終軸繪制細(xì)胞生長曲線。（五）、注意事項(xiàng)1． 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，對(duì)每一種細(xì)胞都應(yīng)測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，然后確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間。2． 避免血清干擾，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。3． 設(shè)空白對(duì)照，與試驗(yàn)平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。最后比色時(shí)，以空白孔調(diào)零【原理】活細(xì)胞的線粒體中存在NADPH相關(guān)的脫氫酶類，可將黃色的MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色甲臜，死亡的細(xì)胞該酶活性喪失，MTT不被還原，用DMSO溶解甲臜后用酶標(biāo)儀于490nm波長處檢測(cè)光密度值?！痉椒ā堪床煌[瘤細(xì)胞的生長速率，將一定數(shù)量的處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞90μl/孔接種于96孔微量培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)后加入藥液10μl/孔（當(dāng)然要根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同的藥物濃度），每個(gè)濃度均為3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)無細(xì)胞調(diào)零孔。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時(shí)間后（時(shí)間就要看你的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)多長時(shí)間，幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)了）加入MTT液20μl/孔（MTT用PBS配制成5mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸出上清液，加入150μlDMSO使甲臜溶解，搖勻，然后用酶標(biāo)儀測(cè)OD570值。【注意事項(xiàng)】懸浮細(xì)胞必須離心后才能吸出上清再加入DMSO.
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