transwell實(shí)驗(yàn)原理與步驟-展示頁
2025-07-04 07:32本頁面
【正文】 定在24 h內(nèi)，否則一旦藥物抑制了細(xì)胞增殖或者誘導(dǎo)出凋亡，使處理組細(xì)胞數(shù)目少于對照組，那么就難以肯定穿過膜的細(xì)胞比對照組少，究竟是由于侵襲被抑制引起，還是處理后細(xì)胞數(shù)目本身就比對照組少而引起的了。我選擇的藥物濃度是用MTT篩選出的72 h的IC50。時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。② 24孔板下室一般加入500 181。24孔板小室一般200 181。三、接種細(xì)胞① 取細(xì)胞懸液100－200 181。個(gè)人認(rèn)為，對照組和處理盡量不要分開計(jì)數(shù)，因?yàn)榧?xì)胞數(shù)目的差異會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)驗(yàn)時(shí)采用密度要自己摸索，因?yàn)椴煌?xì)胞，其侵襲能力是不同的。② 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。二、制備細(xì)胞懸液① 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12－24 h，進(jìn)一步去除血清的影響。l預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15－30 min，使基質(zhì)膠再水化。有基質(zhì)膠的Transwell小室制備l (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37 ℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠。② 水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37 ℃，30min。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200 ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。一、Transwell小室制備1. 無基質(zhì)膠Transwell小室制備① 包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風(fēng)干。用膠原（collagen）的話， mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel ( ug/ul) 6080 181。2. Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300 181。再吸去剩余培養(yǎng)液。但這一步并不是必須的。調(diào)整細(xì)胞密度至110105，個(gè)人認(rèn)為不要超過5105。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞量過多，穿過膜的細(xì)胞會過多過快，如果最后用計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)結(jié)果的話將難以計(jì)數(shù)；而過少的話，可能還沒到檢測的時(shí)間點(diǎn)，所有的細(xì)胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。如果需要對細(xì)胞預(yù)處理而不得不分開計(jì)數(shù)，那么計(jì)數(shù)一定要多重復(fù)幾次，力求準(zhǔn)確，盡量保證對照組和處理組細(xì)胞密度一致。l加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Tr
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