transwell實(shí)驗(yàn)原理與步驟-全文預(yù)覽
【正文】 ,用冰預(yù)冷的甲醇固定30 min。胎盤蘭拒染實(shí)驗(yàn),細(xì)胞活力需大于95 %。取上述稀釋的Matrigel 25 μl 加入transwell 板上室,覆蓋整個(gè)聚碳酯膜,37 ℃,30 min ,使Matrigel 聚合成膠。 加入無血清培養(yǎng)基,37℃,5 %CO2 培養(yǎng)24 h～48h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；4 ℃,12 000rpm 離心,10 min ,取上清； μm 濾膜過濾除菌；分裝,在 20 ℃保存。（3）結(jié)晶紫檢測上文已說過，這里不再贅述，原理與MTT法也是類似的。l DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10 min，使甲?充分溶解。2. 不同廠家不同型號的小室，膜的面積不盡相同，但個(gè)人認(rèn)為，拍照時(shí)還是應(yīng)當(dāng)選取固定的位置，并選擇盡可能多的視野。取若干個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。因?yàn)椋m然經(jīng)過準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，往往穿過膜的細(xì)胞數(shù)仍難以準(zhǔn)確控制，可能某一批實(shí)驗(yàn)穿過的細(xì)胞會特別多，以致細(xì)胞成堆，這種情況下就難以計(jì)數(shù)了，這種情況下就可以用醋酸脫色后用酶標(biāo)儀檢測。%結(jié)晶紫染色，這種方法有如下優(yōu)勢：(1). 不需要固定細(xì)胞，直接染色即可。同時(shí)從藥物被吸收進(jìn)去，進(jìn)而發(fā)揮作用，影響MMPs表達(dá)，到最后釋放到培養(yǎng)基中，還需要一個(gè)過程。我選擇的藥物濃度是用MTT篩選出的72 h的IC50。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。24孔板小室一般200 181。個(gè)人認(rèn)為，對照組和處理盡量不要分開計(jì)數(shù)，因?yàn)榧?xì)胞數(shù)目的差異會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。② 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。l預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15－30 min，使基質(zhì)膠再水化。l (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37 ℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200 ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。無基質(zhì)膠Transwell小室制備① 包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風(fēng)干。另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel ( ug/ul) 6080 181。Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300 181。但這一步并不是必須的。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞量過多，穿過膜的細(xì)胞會過多過快，如果最后用計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)結(jié)果的話將難以計(jì)數(shù)；而過少的話，可能還沒到檢測的時(shí)間點(diǎn)，所有的細(xì)胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞
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