【正文】 化的酶反映偶聯(lián)使第一個(gè)酶反映的產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成第二個(gè)酶的具有光吸收變化的產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行測(cè)量。（8） 誘導(dǎo)契合說(shuō)：1958年Koshland提出，當(dāng)酶分子與底物分子接近時(shí)，酶蛋白受底物分子誘導(dǎo)，其構(gòu)想發(fā)生有利于底物結(jié)合的變化，酶與底物在此基礎(chǔ)上互補(bǔ)契合進(jìn)行反應(yīng)。（9） 反饋抑制：許多小分子物質(zhì)的合成是由一聯(lián)串的反應(yīng)組成的，催化此物質(zhì)生成的第一步的酶，往往被它們終端產(chǎn)物抑制。這種抑制叫反饋抑制。（10） 多酶復(fù)合體：由幾種酶靠非共價(jià)鍵彼此嵌合而成。， AgNO3，求該酶的最低相對(duì)分子質(zhì)量。（Mr:92103）在最適條件下，試計(jì)算：（1）酶的比活力。[500U/mg]（2）轉(zhuǎn)換數(shù)。[]解：（1）比活力= （2）轉(zhuǎn)換數(shù)=1247。（1106/92103106）=，其轉(zhuǎn)換數(shù)為6104min1，試計(jì)算該酶在細(xì)胞內(nèi) 濃度（假設(shè)新鮮組織含水80%，并且全部在細(xì)胞內(nèi)）。[107 mol/L]解：1/610440247。（180%103）=[107 mol/L，其相對(duì)分子質(zhì)量為120103，由6個(gè)相同亞基組成。純酶的Vmax為2800U/mg酶。它的一個(gè)活力單位規(guī)定為：在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下，37℃、15min內(nèi)水解10μmol焦磷酸所需要的酶量。問(wèn)：（1）酶mg酶在每秒鐘內(nèi)水解多少mol 底物？[105mol]。（2）每mg酶中有多少mol的活性部位（假設(shè)每個(gè)亞基上有一個(gè)活性部位）？[5108mol活性中心]。（3）酶的轉(zhuǎn)換數(shù)是多少？[622s1或622mol焦磷酸/（smol）酶活性中心]解：（1）280010/151/（60106）1=105 mol （2）1103/1201036=5108 mol （3）105247。1103/1201031/6=622，以酪蛋白為底物，用Folin酚比色法測(cè)定酶活力，得知每小時(shí)產(chǎn)生1500μg酪氨酸。另取2ml酶液，若以每分鐘產(chǎn)生1μg 酪氨酸的酶量為1個(gè)活力單位計(jì)算，根據(jù)以上數(shù)據(jù)，求出：（1）1ml酶液中所含蛋白質(zhì)量及活力單位。[，250U]（2）比活力。[400U/mg蛋白質(zhì)]（3）1g酶制劑的總蛋白含量及總活力。[，105U]解：（1）247。（225/25）= 1500/60247。（25/25）=250U （2）250247。=400U/mg （3）247。（125/25）1103= 103mg= 1500/60247。（25/25）247。（125/25）103=105U，用水溶解成1000ml，從中取出1ml測(cè)定淀粉酶活力。計(jì)算每g酶制劑所含淀粉酶活力單位數(shù)？[3000U]（淀粉酶活力單位定義：在最適條件下每小時(shí)分解1g淀粉的酶量稱(chēng)為1個(gè)活力單位）解：60247。（1/10001）=3000U，竟測(cè)定得到下列數(shù)據(jù)：試計(jì)算比活力、百分產(chǎn)量及純化倍數(shù)。[比活力：180U/mg蛋白質(zhì)，百分產(chǎn)量：17%，純化倍數(shù)：9倍]體積/ml活力單位/（U/ml）蛋白質(zhì)/（mg/ml）初提取液（NH4）2SO4鹽析1205200810104解：（1）810/=180U/mg （2）8105247。（200120）100%=17% （3）180247。（200/10）=9第九章 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)提要酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速率以及影響此速率各種因素的科學(xué)。它是以化學(xué)動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)討論底物濃度、抑制劑、pH、溫度及激活劑等因素對(duì)酶反應(yīng)速率的影響?；瘜W(xué)動(dòng)力學(xué)中在研究化學(xué)反應(yīng)速率與反應(yīng)無(wú)濃度的關(guān)系時(shí)，常分為一級(jí)反應(yīng)、二級(jí)反應(yīng)及零級(jí)反應(yīng)。研究證明，酶催化過(guò)正的第一步是生成酶底物中間產(chǎn)物，MichaelisMenten該呢舉中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)的理論推導(dǎo)出酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式，即Km、Vmax、kcat、kcat/Km。Km是酶的一個(gè)特征常數(shù)，以濃度為單位，Km有多種用途，通過(guò)直線作圖法可以得到Km及Vmax。Kcat稱(chēng)為催化常數(shù)，又叫做轉(zhuǎn)換數(shù)（TN值），它的單位為s1，kcat值越大，表示酶的催化速率越高。kcat/Km常用來(lái)比較酶催化效率的參數(shù)。酶促反應(yīng)除了單底物反應(yīng)外，最常見(jiàn)的為雙底物反應(yīng)，按其動(dòng)力學(xué)機(jī)制分為序列反應(yīng)和乒乓反應(yīng)，用動(dòng)力學(xué)直線作圖法可以區(qū)分。酶促反應(yīng)速率常受抑制劑影響，根據(jù)抑制劑與酶的作用方式及抑制作用是否可逆，將抑制作用分為可逆抑制作用及不可逆抑制作用。根據(jù)可逆抑制劑與底物的關(guān)系分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制及反競(jìng)爭(zhēng)性抑制3類(lèi)，可以分別推導(dǎo)出抑制作用的動(dòng)力學(xué)方程。競(jìng)爭(zhēng)性抑制可以通過(guò)增加底物濃度而解除，其動(dòng)力學(xué)常數(shù)Kˊm變大，Vmax不變；非競(jìng)爭(zhēng)性抑制Km不變，Vˊmax變??；反競(jìng)爭(zhēng)性抑制Kˊm及Vˊmax均變小。通過(guò)動(dòng)力學(xué)作圖可以區(qū)分這3種類(lèi)型的可逆抑制作用?？赡嬉种苿┲凶钪匾氖歉?jìng)爭(zhēng)性抑制，過(guò)度態(tài)底物類(lèi)似物為強(qiáng)有力的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。不可逆抑制劑中，最有意義的為專(zhuān)一性Ks型及kcat型不可逆抑制劑。研究酶的抑制作用是研究酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶的催化機(jī)制、闡明代謝途徑以及設(shè)計(jì)新藥物的重要手段。溫度、pH及激活劑都會(huì)對(duì)酶促反應(yīng)速率產(chǎn)生重要影響，酶反應(yīng)有最適溫度及最適pH，要選擇合適的激活劑。在研究酶促反應(yīng)速率及測(cè)定酶的活力時(shí)，都應(yīng)選擇酶的最適反應(yīng)條件。習(xí)題%時(shí)，在Km和[S]之間有何關(guān)系？[Km=[S]]解：根據(jù)米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得：=Vmax[S]/(Km+[S])Km=[S]102 mol/L，當(dāng)?shù)孜镞^(guò)氧化氫濃度為100mol/L時(shí)，求在此濃度下，過(guò)氧化氫酶被底物所飽和的百分?jǐn)?shù)。[80%]解：fES=[S]/（Km+[S]）=100103/(102+100103)=80%→P測(cè)得如下數(shù)據(jù)：[S]/molL1V/nmolL1min1106105104103102（1） 計(jì)算Km及Vmax。[Km：105，Vmax：75 nmolL1min1]（2） 當(dāng)[S]= 5105 mol/L時(shí)，酶催化反應(yīng)的速率是多少？[ nmolL1min1]（3） 若[S]= 5105 mol/L時(shí)，酶的濃度增加一倍，此時(shí)V是多少？[100 nmolL1min1]（4） 表中的V是根據(jù)保溫10min產(chǎn)物生成量計(jì)算出來(lái)的，證明V是真正的初速率。解：（1）由米氏方程得：15=Vmax106/ (Km+106)……① 60=Vmax104/（Km+104）……②由①、②得：Km=105，Vmax=75 nmolL1min1（2）V=755105/（105+5105）= nmolL1min1（3）502=100 nmolL1min1（4）帶如米氏方程可驗(yàn)證。105 molL1，Vmax為22μmolL1 min1，底物濃度為2104 molL1。試計(jì)算：（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，（3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的濃度均為5104 molL1時(shí)的酶催化反映速率？這3中情況的Ki值都是3104 molL1，（4）上述3種情況下，抑制百分?jǐn)?shù)是多少？[（1） min1，24%；（2） min1，%；（3） min1，%]解：（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的米氏方程為：V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])代入數(shù)據(jù)得：V= min1i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=24%（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的米氏方程為：V=Vmax[S]/((Km+[S])(1+[I]/Ki))代入數(shù)據(jù)得：V= min1i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=%（3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S](1+[I]/Ki))代入數(shù)據(jù)得：V= min1i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=%6．今制得酶濃度相同、底物濃度不同的幾個(gè)反應(yīng)混合液，并測(cè)得反應(yīng)初速率，數(shù)據(jù)見(jiàn)下表。請(qǐng)利用“EadieHofstee”方程式，用圖解法求出Km值及Vmax值。這種作圖法與LineweaverBurk作圖法比較有何優(yōu)點(diǎn)？[Vmax=160μmolL1 min1,Km=105 molL1][S]/molL1V/μmolL1min11041301041101048910562105531053810532解：將米氏方程改寫(xiě)成：V=VmaxKmV/[S],以VV/[S]作圖，得一直線，其縱截距為Vmax，斜率為Km，由圖得Vmax=160μmolL1min1,Km=105 molL1優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)點(diǎn)相對(duì)集中于直線上，Km和Vmax測(cè)定值較準(zhǔn)確。，當(dāng)?shù)孜餄舛萚S]=Km，競(jìng)爭(zhēng)抑制劑濃度[I]=Ki時(shí)，反應(yīng)的初速率是多少？[V=1/3Vmax]解：根據(jù)米氏方程可得：V=Vmax[S]/ (Km(1+[I]/Ki)+[S]),其中[S]=Km，[I]=KiV= VmaxKm/ (Km(1+Ki/Ki)+Km)=1/3 Vmax：（1）無(wú)抑制劑和有抑制劑的Vmax和Km值。[無(wú)抑制劑時(shí)Km=105 molL1，Vmax=50μmolL1min1，有抑制劑時(shí)：Km=105 molL1，Vmax=50μmolL1min1]（2）EI復(fù)合物的解理常數(shù)Ki。[Ki= 103molL1][S]/molL1V/μmolL1min1無(wú)抑制劑有抑制劑（103 molL1）105105105105105解：（1）無(wú)抑制劑時(shí)：V=Vmax[S]/(Km+[S])，將表中數(shù)據(jù)代入此式可得Km=105 molL1，Vmax= 對(duì)表中數(shù)據(jù)用V對(duì)[S]作圖，求Km值，可判斷有抑制劑時(shí)，Km值明顯增大，故該抑制劑應(yīng)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。據(jù)V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])以及Vmax不變的性質(zhì)可得，此時(shí)Vmax=，Km=105 molL1，Ki= 103molL19．同上。，求出下列參數(shù)（反應(yīng)混合物中酶量為103μmol）。（1）Km；（2）Vmax；（3）kcat/Km；(4)轉(zhuǎn)換數(shù)。[Km:5104molL1；Vmax:6μmolL1min1；kcat/Km: 2105 mol1Ls1；轉(zhuǎn)換數(shù):100s1]解：Vmax=kcat[Et]=k3[E]=k3[ES]？胰凝乳蛋白酶的轉(zhuǎn)換數(shù)100s1，DNA聚合酶是15s1。（1） 胰凝乳蛋白酶結(jié)合第五比DNA聚合酶有更高的親和性。（2） 胰凝乳蛋白酶反映速率比DNA聚合酶反映速率更大。（3） 在特別的酶濃度和飽和底物水平下胰凝乳蛋白酶反應(yīng)速率比DNA聚合酶在相同條件下更低。（4） 在飽和底物水平下，兩種酶的反應(yīng)速率。，它符合MichaelisMenten動(dòng)力學(xué)，其Km為1106molL1。 molL1時(shí)。試問(wèn)：底物濃度分別為102molL103molL1和106molL1時(shí)的反應(yīng)初速率是多少？[1107 molL1min1，5108 molL1min1]解：∵Km=1106molL1《[S]= ∴V=Vmax=將題中數(shù)據(jù)代入米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得：設(shè)[S]=xKmV=VmaxxKm/((x+1)Km)=x/(x+1)Vmax=1/(1+1/x)VmaxV1= V2= V3=1/2Vmax=13．假設(shè)2104 molL1的[I]抑制了一個(gè)酶催化反應(yīng)的75%，計(jì)算這個(gè)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的Ki？[105 molL1]解：i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=75% Vi/Vo=1/4 → Vo=4Vi……①再根據(jù)無(wú)抑制劑時(shí)的米氏方程：Vo=Vmax[S]/(Km+[S])……②加入非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑時(shí)：V=Vˊmax[S]/((Km+[S])(1+[I]/Ki))……③，此時(shí)Vmax變小，Km不變。由①②③得：Ki=2104/（4Vˊmax/ Vmax1） Vˊmax = VmaxKi=105 molL1104 molL1 。Ki為2105mol/L。103mol/L時(shí)，要得到75%的抑制，需競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的濃度是多少？[104mol/L]解：i%=（1a）100%=（1Vi/Vo）100%=75% Vi/Vo=1/4 → Vo=4Vi……①再根據(jù)無(wú)抑制劑時(shí)的米氏方程：Vo=Vmax[S]/(Km+[S])……②加入競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑時(shí)：V=Vˊmax[S]/(Kˊm(1+[I]/Ki) +[S])……③，此時(shí)Vmax變小，Km不變。由①②③得：[I]=4KmKi/KˊmKi+3[S][Ki]/Kˊm加入抑制劑時(shí)，Km=Kˊm ∴[I]= 104mol/L。什么是過(guò)度態(tài)底物類(lèi)似物？它屬于何種類(lèi)型抑制劑？答：Ks型抑制劑根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，具有底物類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，可以和相應(yīng)的酶結(jié)合，同時(shí)還代有一個(gè)活潑的化學(xué)基團(tuán)，能與酶分子中的必需基團(tuán)反應(yīng)進(jìn)行化學(xué)修飾，從而抑制酶。因其專(zhuān)一性取決于抑制劑與活性部位必需基團(tuán)在反應(yīng)前形成非共價(jià)絡(luò)合物的解離常數(shù)以及非活性部位同類(lèi)基團(tuán)形成非共價(jià)絡(luò)合物的解離常數(shù)之比，即Ks比值，故這類(lèi)抑制劑稱(chēng)不可逆Ks抑制劑。例如：胰蛋白酶要求催化的底物具有一個(gè)帶正電荷的側(cè)鏈，如Lys、Arg側(cè)鏈。對(duì)甲苯磺酰L賴(lài)氨酰氯甲酮（TLCK）和胰蛋白酶活性部位必需集團(tuán)His57共價(jià)結(jié)