【正文】 。實驗十三 牛、羊的胚胎移植一、實驗?zāi)康耐ㄟ^應(yīng)用激素對牛、羊進行超數(shù)排卵及同期發(fā)情處理，以及胚胎移植全過程的觀察，了解動物胚胎移植的程序，主要技術(shù)環(huán)節(jié)操作要領(lǐng)。二、實驗材料選擇健康、營養(yǎng)良好、無繁殖疾病、生殖功能正常的母牛，或母羊，做供體牛（羊）受體牛（羊）。藥品：PMSG、FSH、LH、PGF2α、靜松靈注射液、普魯卡因注射液、PBS、抗菌素等。器械：子宮擴張棒、二路沖卵器、注射器、輸卵器、卡蘇槍、解剖鏡、腹腔鏡、集卵瓶、檢卵杯、吸卵管、羊手術(shù)臺（2個）、手術(shù)刀、剪、鑷子、創(chuàng)布、縫合針等兩套。三、實驗方法（一）牛的非手術(shù)法胚胎移植與超數(shù)排卵處理受體牛胚胎移植前第6天注射PMSG500—800IU，前3—4天注射PGF2α12mg（子宮灌注法）。供體牛性周期的第11天，肌注PMSG30004000IU，第13天肌肉注射PGF2α2030mg，促使黃體退化，第15天供體牛發(fā)情（此天為0天）間隔812小時輸精23次，第7天收集胚胎?；蛴肍SH在供體手性周期的第1114天每日上午8時下午5時各肌肉注射FSH50IU，總劑量400IU，第13天注射PGF2α2030mg,第15天供體牛發(fā)情。以后處理同第一種方法，在第一次輸精同時注射LH 160IU，共輸精3次。胚胎的收集（采卵）①供體牛在直檢架內(nèi)保定，用繩纏尾拉向一側(cè)，排出直腸內(nèi)的宿糞，清洗陰戶周圍。②肌肉注射靜松靈35ml作鎮(zhèn)靜。③2%普魯卡因注射液4ml作尾椎硬膜外局部麻醉，以松馳子宮頸環(huán)肌。④組裝沖卵集卵的裝置，準(zhǔn)備1000ml沖卵液加溫到38℃?zhèn)溆?。⑤使用子宮擴張棒擴張子宮頸口。⑥將帶有通心鋼絲的采卵軟管插入子宮角。⑦沖氣20ml，使沖卵管固定于子宮基部。⑧用100ml注射器及取38℃的沖卵液4060ml，注入子宮角，再回收沖卵液，反復(fù)沖洗，一側(cè)子宮角總計用沖卵液50ml,一側(cè)子宮角沖完，以同樣方法沖洗另一側(cè)子宮角，二側(cè)沖完，向子宮的內(nèi)注入抗菌藥物。胚胎的檢查（檢卵）①將盛有沖卵回收液的集卵管靜置1020min,然后從集卵管下端放液于檢卵標(biāo)，置于解剖鏡下觀察，以1040倍仔細將胚胎檢出，放入盛有移卵液的凹面培養(yǎng)皿內(nèi)，仔細觀察胚胎的形態(tài)和發(fā)育情況。②收集外形整齊，大小一致，卵裂球分裂均勻，外膜完整的清晰明亮的桑椹胚或適宜胚期的胚胎，吸入塑料細管內(nèi)（用五段法：移卵液—空氣—含有移卵液的胚胎—空氣—移放液）再將細管放入輸卵器中胚胎的移植（授卵）。①選擇同期發(fā)情處理的與供體牛相一致的母牛做受體。②按常規(guī)輸精法，將輸卵器插入宮頸，并深入黃體側(cè)子宮角，將胚胎移入。（二）羊的手術(shù)法胚胎移植操作同期發(fā)情與超數(shù)排卵處理受體羊于胚胎移植前7天注射PGF2α2mg，移植前6天注射FSH50 IU每天試情并記載發(fā)情開始及結(jié)束時間。供體羊在發(fā)情周期第16天開始注射FSH 100IU，每天一次，共三次，并在第17天注射PGF2α2mg，供體羊發(fā)情結(jié)束配種，并注射LH 150IU,配種23次，每天上午、下午試情配種，配種開始后第四天手術(shù)胚胎移植。胚胎收集由于山羊無法進行直腸檢查，手術(shù)前應(yīng)用腹腔鏡技術(shù)檢查供體和受體的卵巢和子宮，棄除那些不適宜手術(shù)的羊只，卵巢上有正常黃體者，手術(shù)時直接將胚胎移植于該側(cè)子宮角，不需再檢查卵巢，這樣不僅可縮短手術(shù)過程，減少手術(shù)創(chuàng)口污染的機會，更重要的是可避免牽拉及檢查卵巢時可能造成的卵巢及黃體的機械損傷，提高成功率。將供體羊麻醉后，在腹中線或腹側(cè)作一切口，先將一側(cè)輸卵管及子宮角移出腹腔，用注射器吸取沖卵液注入子宮角尖端，在輸卵管的傘部接取沖卵液。胚胎檢驗 同牛的胚胎檢驗胚胎的移植①麻醉手術(shù)法同供體②用輸卵滴管吸取正常胚胎（帶小量液體）注入輸卵管的腹腔孔。③用1ml注射器及封閉長針頭吸取胚胎注入子宮角內(nèi)。四、作業(yè)總結(jié)手術(shù)法和非手術(shù)法胚胎移植的程序和主要技術(shù)環(huán)節(jié)。實驗十四 卵母細胞體外培養(yǎng)與體外受精 一、實驗?zāi)康?了解卵母細胞體外培養(yǎng)與體外受精的程序和操作要領(lǐng)，掌握卵母細胞體外培養(yǎng)與體外受精的方法。 二、實驗材料 卵巢、冷凍精液、M199培養(yǎng)液、血清、促性腺激素、雌激素、石蠟油、A23181%BSA、Tyrode’s改良液。 器械：培養(yǎng)皿、15ml試管、膠塞、注射針頭、培養(yǎng)箱、吸管、離心管。三、實驗內(nèi)容 （一）卵母細胞的體外培養(yǎng) 培養(yǎng)液的準(zhǔn)備 用于卵母細胞體外成熟的基礎(chǔ)培養(yǎng)液應(yīng)用最廣泛的是M199。使用時需添加一定濃度的血清、促性腺激素和雌激素等。 培養(yǎng)方法 卵母細胞體外培養(yǎng)一般采用微滴法、封閉法和開放法三種。 （1）微滴法 先將成熟培養(yǎng)液在組織培養(yǎng)皿中做成50—100ul的微滴并覆蓋石蠟油，然后將5—10枚卵母細胞放入其中培養(yǎng)。如培養(yǎng)單個卵母細胞，則制備10ul的微滴。此法適用于多組對比試驗，或來源于不同母畜的卵母細胞的分別培養(yǎng)等。 （2）封閉法 先將卵母細胞放入盛有2—3ul成熟培養(yǎng)液的15ul試管中，用膠塞密封試管口并在膠塞上插入一注射針頭，然后從針頭充入含有5% CO2的空氣，充氣完畢后將針頭拔出。 （3）開放法 先將1—2ul成熟培養(yǎng)液放入培養(yǎng)皿中，然后將含有卵母細胞的表面皿置于恒溫的含有5%CO2空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 牛、豬、羊和馬等家畜的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的溫度一般為38—39℃，人和齒類動物為37℃。所有哺乳動物卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的氣相一般要求在含5%CO2的空氣和最大濕度的環(huán)境。 牛和羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的時間一般為22—24h，而馬為30—36h。豬為40—44h。 （三）卵母細胞的體外受精 卵母細胞要完成體外受精過程，其先決條件是需要成熟的卵子和精子，其次，亦依賴于受精的環(huán)境等因素。 精子的制備 用于體外受精的精液一般為冷凍精液，冷凍精液中除了富含精漿外，還含有防凍劑、卵黃或牛奶等成分，受精前必須把這些成分棄掉，以利于卵母細胞受精過程的完成。同時，通過精子的準(zhǔn)備，可以篩選富含活力強的精子用于體外受精。因為精子活力的強弱直接影響到受精的效果。精子的準(zhǔn)備一般采用如下方法。 （1）懸浮法 將1—2支細管冷凍精液解凍后，放入含有3—5ul的獲能液或受精液的試管底部，在培養(yǎng)箱中孵育約30min后，用吸管吸取上半部分液體并離心洗滌1—2次，即可獲得90%以上活力強的精子。 （2）直接離心法 將精液直接放入含有5—10ul的獲能液或受精液的離心管中，而后離心2次即可。 精子獲能處理 精子與卵母細胞受精之前，必須獲得一種受精的能力。精子的獲能處理一般有如下三種方法。 （1）肝素處理法 此法是目前最為廣泛應(yīng)用的精子獲能處理方法。其處理方法是，將一定濃度的肝素直接添加到受精液中進行受精，受精液中肝素濃度一般為2—10ug/ml。不同的公牛要求不同濃度的肝素，故當(dāng)使用不同公牛精液時，應(yīng)預(yù)先測定該公牛所需的最佳肝素濃度。 （2）鈣離子載體法 首先將精子加入含有0、5—0umol/L A23187的不含BSA的受精液中處理約5min，然后加入等量的含有1%BSA的受精液，以終止A23187的作用，隨后，精子可用于體外受精。 （3）高滲溶液處理法 一般使用的高滲溶液為360—380mosm。如此高滲的溶液對精子有一定的高滲打擊作用，但受精效果不錯。 受精液 通常使用的受精液是Tyrode’s改良液，其主要成分見下表。Tyrode’s改良液組成成分表 組成成分 濃度（mmol/L） 組成成分 濃度（mmol/L） NaCl KCl NaHCO3 乳酸鈉 丙酮酸鈉 葡萄糖 肝素 — 咖啡因 — 青霉胺 亞牛黃酸 腎上腺素 BSA（脫脂） 硫酸慶大霉素 25mg/L—，滲透壓為290—310mosm。 受精方法 受精方法主要有三種：微滴法、四孔培養(yǎng)板法和顯微注射法。 （1）微滴法 此法是目前應(yīng)用最為廣泛的一種受精方法。其做法是先在培養(yǎng)皿中用受精液制作成20ul或40ul的微滴并覆蓋石蠟油，置于CO2培養(yǎng)箱中平衡至少2h。然后，每滴放入10—20枚已培養(yǎng)成熟的卵母細胞和經(jīng)處理的精子，精子在受精液滴中的最終濃度一般為1—2*106/ml。不同的公牛要求不同的精子濃度，因此，使用不同公牛時，應(yīng)預(yù)先測定該公牛所需的精子最佳濃度。 （2）四孔培養(yǎng)板法 —，置于CO2培養(yǎng)箱中平衡至少2h。然后，每孔放入50—100枚已經(jīng)培養(yǎng)成熟的卵母細胞和經(jīng)處理的精子，精子在受精液滴中的最終濃度同上。 精卵共培養(yǎng)的時間、溫度和氣相 受精后，卵母細胞應(yīng)立即放入溫度為39℃，含5%CO2的空氣和最大相對濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24—44h。受精后40—44h檢查受精卵的分裂率。四、作業(yè)總結(jié)體外授精的過程，描繪卵母細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，描述體外培養(yǎng)過程中受精卵的發(fā)育形態(tài)。