【正文】 。歐盟目前唯一批準作為獸藥在牛、馬和寵物上使用的 β－興奮劑是克喘素，用來治療馬、犢牛的哮喘病以及在母牛保胎和緩解產痛上使用。至今仍未批準包括克喘素在內的任何 β－興奮劑作為營養(yǎng)重分配劑使用。作為營養(yǎng)重分配劑，克喘素的有效劑量是治療劑量的 5～ 10倍，而且使用的時間要長得多（ Godfrey,1996）。除特殊情況外，任何動物體內有 β－興奮劑殘留都是違法的。 世界和中國的形勢 ? 一些歐盟國家，執(zhí)行最大殘留限制，如英國規(guī)定，每 kg食用組織中克喘素的最大殘留量為 ,荷蘭規(guī)定每 kg肝中克喘素的最大殘留量為 1μg。每個歐盟成員國都必須監(jiān)控本國動物和肉品中的 β－興奮劑殘留量，抽樣的頻率取決于動物的種類，要保證在置信區(qū)間為 95％的情況下，揭示 1％概率的 β－興奮劑濫用。抽樣時不提前通知，如果檢驗結果呈陽性，就增加抽樣的頻率。近年有人試圖篩選出長效、無害、具有營養(yǎng)重分配功能的 β－興奮劑，但直到目前為止，還看不出這類藥物能夠獲得有關權威機構批準的希望。在此之前，不論是科研教學機構，還是有關生產部門，出于對公眾健康的責任，都不應對 β－興奮劑的應用效果作過多的渲染。 世界和中國的形勢 ? 我國目前根據(jù)無公害檢測要求， β－興奮劑類每種物質要求在尿液和組織中不超過2ppb，根據(jù)藥物代謝原理和實際市場情況，目前主要檢測的部位是尿液、肝臟和肌肉。檢測尿液可以看出 1~2天之內的飼喂情況，肝臟是長期飼喂中殘留含量最高的臟器器官，肌肉則是和市場需求最多，故檢測這三種樣品就可以監(jiān)控 β－興奮劑的使用情況。 可供選擇的方法 隨著國家對于 β－興奮劑了解的不斷深入，檢測要求也越來越嚴，就目前國家的檢測要求而言，最常用的檢測方法主要有 2類： ? 一種是利用 β－興奮劑的物理化學性質進行檢測的方法，比如氣相質譜法和液相質譜法。 ? 另一種是利用生物反應為原理的方法，既抗原抗體反應方法，比如酶聯(lián)免疫方法和金標試紙條法。 兩類方法配合使用，是如今國內外最常用的辦法，可以達到快速、準確的目的 。 方法的特點 ? 氣相質譜法和液相質譜法 穩(wěn)定，費時，對人員操作有較高要求，主要用于確證方面。 ? 酶聯(lián)免疫方法和金標試紙條法 快速，簡單，比較容易上手，但干擾多，對產品本身質量要求高，常用于大面積篩選方面。 ELISA原理 ? ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。 加入樣品和酶標記物 反應 60分鐘 E E E E E E 洗 板，洗去多余的酶標記物 E E E E E E 加入發(fā)色劑，顏色逐漸變藍 S P E E E E 加入停止液，顏色變黃 E E E E 使用中的一些問題 ? 1．樣品吸光度值高于標準曲線最大吸光度值 原因：零標準稀釋錯誤或稀釋液有一定的待測物（抗原或抗體）。 樣品中含有干擾物質，而且稀釋液對樣品的 代表性差。 解決：對于第一種情況，可以用樣品中最大吸光度作為零點做曲線。對于后兩種情況，則需對樣品進行適當處理，如稀釋、抽提等。 使用中的一些問題 ? 2．樣品吸光度值低于標準曲線最小吸光度值 原因：待測物含量高于標準曲線最大濃度。 解決：稀釋后再測。 使用中的一些問題 ? 3．最大吸光度值較低（雖可以建立曲線，但重復性差） 原因：抗體效價降低，或酶活性下降。 酶活性雖未降低，但發(fā)生脫落。 底物變質。 固相載體受污染（如灰塵等） 使用中的一些問題 ? 4 影響酶促反應的因素 溫度：溫度的變化與蛋白質的失活是一對矛盾，溫度低時蛋白質不失活，但反應時間長。溫度高時反應時間短，但蛋白質更容易失活。過氧化物酶最適溫度為 15度，但加入非離子洗滌劑后可以適當提高 pH值：因為酶與底物都有許多的極性基團，且在游離狀態(tài)下酶與底物才結合，游離狀態(tài)不同，所帶電荷不同。 pH值多在中性、弱酸、弱堿性。過氧化物酶對 pH值要求不高，變化 1個單位的范圍基本上沒有影響。 使用中的一些問題 ? 5 操 作 中 影 響 結 果 的 因 素 ? 試劑必須回到 2024度，而并不是室溫是 2024度就可以。試劑溫度低會導致吸光度低。 ? 標準使用前一定混勻，否則濃度不準，吸光度會變化。 ? 酶標記物稀釋度不夠，酶標記物含量增高，結果的吸光度會高。 ? 注意不要污染孔底（如不小心手指碰到），否則吸光度值會降低，如果污染，可用鏡頭紙擦凈。 ? 洗板時，洗板次數(shù)的多少與吸光度值的高低是一對矛盾。 如果機洗，因為不能讓注水頭碰到微孔底部，所以有一定的殘留， 應多吸幾次，吸光度會稍微降低，但現(xiàn)梯度有。 如果手洗， 250ul洗 3次就可以，注意孔間防止污染。 ? 注意孔不要干燥，否則吸光度會低。 ? 快速讀取，隨時間增長，所有的吸光度值要有所降低。 使用中的一些問題 ? 6 誤 差 的 來 源 隨機誤差：通過建立標準曲線控制在一定的范圍內 系統(tǒng)誤差：引起測量值偏向一側（偏差） 誤差的來源 1 實驗誤差：包括移液誤差、稀釋誤差、回歸誤差、錯分誤差（分離不完全） 系統(tǒng)誤差： a 時間、條件、技術 b 酶標儀的精確度 c 計算中的誤差（回歸誤差、曲線兩端的誤差） 使用中的一些問題 質量控制 1 內部質控：控制隨機誤差（板內、批內、批間） 2 外部質控：控制系統(tǒng)誤差（方法的評定、不同實驗者的比較） 質量評價 1 精確度（重復性） a 變異系數(shù)法 CV=Sn/X 批間和批內要求不同，一般是在 10%以內 ME b 反應 誤差關系法 RER=—— 要求 RER MR 注： ME=各個樣本的吸光度值的標準差 / 樣品總數(shù) MR=各個樣本的吸光度值的和 / （樣品總數(shù) x重復測定的次數(shù)） 2 靈敏度：等于 X2SD的 OD值在曲線查出的濃度，得下限值。陽性最小檢出指數(shù) DI（ +） =真陽性 /（真陽性 +假陰性） 3 準確度：不準確度 2=（偏差） 2 +（ CV） 2 4 特異性： Y=S/Z （假定 100%的抗原與 50%抗體結合） S為標準抗原與 50%抗體結合時濃度 Z為標準抗原類似物與 50%抗體結合時濃度 陰性最小檢出指數(shù) DI（ — ） = 真陰性 /（真陰性 +假陽性） 使用中的一些問題 剔除的依據(jù) 1 OD值 3Sn 2 RER 3 若重復 3次，則首先剔除板邊孔（邊緣效應） CV正常值 2倍的標準值 洗板 建議至少洗滌 5~6次（每次靜止 3分鐘， ~），以除去固定較弱的反應物，減少交叉反應或阻止未結合的免疫反應物吸附到載體上，提高靈敏度；或快速洗滌 3~4次，最后一次靜止 3~5分鐘，且注滿洗滌液。 最常用的緩沖液為 PBS緩沖液，其中最好添加硫柳汞鈉鹽，但不添加也可以。 實驗計算結果 AlogC作圖法： A= a + blogC的函數(shù)關系，圖形實際不是一條直線，所以 A和 C的相關系數(shù)較低。 A/AOlogC作圖法： A/ AO = a + blogC的函數(shù)關系，相關系數(shù)仍然低（絕對值小于 ）但計算簡便。 LogitYlog作圖法： LogitY = a + blogC的函數(shù)關系，相關系數(shù) 根據(jù) LogitY=Ln（ A/（ AOA））計算各個標準點的 LogitY值。 計算各個標準點濃度對數(shù) logC。 建立 logC與 LogitY回歸方程，求出 a、 b和 r。 根據(jù) C=antilog（ LogitYa） /b計算樣品濃度。 蛋白芯片技術介紹 Thank you祝大家身體健康！工作順利！電話： 01062155788 62114669 傳真： 01082109402 6211851