【正文】 。歐盟目前唯一批準作為獸藥在牛、馬和寵物上使用的 β－興奮劑是克喘素，用來治療馬、犢牛的哮喘病以及在母牛保胎和緩解產(chǎn)痛上使用。至今仍未批準包括克喘素在內(nèi)的任何 β－興奮劑作為營養(yǎng)重分配劑使用。作為營養(yǎng)重分配劑，克喘素的有效劑量是治療劑量的 5～ 10倍，而且使用的時間要長得多（ Godfrey,1996）。除特殊情況外，任何動物體內(nèi)有 β－興奮劑殘留都是違法的。 世界和中國的形勢 ? 一些歐盟國家，執(zhí)行最大殘留限制，如英國規(guī)定，每 kg食用組織中克喘素的最大殘留量為 ,荷蘭規(guī)定每 kg肝中克喘素的最大殘留量為 1μg。每個歐盟成員國都必須監(jiān)控本國動物和肉品中的 β－興奮劑殘留量，抽樣的頻率取決于動物的種類，要保證在置信區(qū)間為 95％的情況下，揭示 1％概率的 β－興奮劑濫用。抽樣時不提前通知，如果檢驗結(jié)果呈陽性，就增加抽樣的頻率。近年有人試圖篩選出長效、無害、具有營養(yǎng)重分配功能的 β－興奮劑，但直到目前為止，還看不出這類藥物能夠獲得有關(guān)權(quán)威機構(gòu)批準的希望。在此之前，不論是科研教學(xué)機構(gòu)，還是有關(guān)生產(chǎn)部門，出于對公眾健康的責(zé)任，都不應(yīng)對 β－興奮劑的應(yīng)用效果作過多的渲染。 世界和中國的形勢 ? 我國目前根據(jù)無公害檢測要求， β－興奮劑類每種物質(zhì)要求在尿液和組織中不超過2ppb，根據(jù)藥物代謝原理和實際市場情況，目前主要檢測的部位是尿液、肝臟和肌肉。檢測尿液可以看出 1~2天之內(nèi)的飼喂情況，肝臟是長期飼喂中殘留含量最高的臟器器官，肌肉則是和市場需求最多，故檢測這三種樣品就可以監(jiān)控 β－興奮劑的使用情況。 可供選擇的方法 隨著國家對于 β－興奮劑了解的不斷深入，檢測要求也越來越嚴，就目前國家的檢測要求而言，最常用的檢測方法主要有 2類： ? 一種是利用 β－興奮劑的物理化學(xué)性質(zhì)進行檢測的方法，比如氣相質(zhì)譜法和液相質(zhì)譜法。 ? 另一種是利用生物反應(yīng)為原理的方法，既抗原抗體反應(yīng)方法，比如酶聯(lián)免疫方法和金標試紙條法。 兩類方法配合使用，是如今國內(nèi)外最常用的辦法，可以達到快速、準確的目的 。 方法的特點 ? 氣相質(zhì)譜法和液相質(zhì)譜法 穩(wěn)定，費時，對人員操作有較高要求，主要用于確證方面。 ? 酶聯(lián)免疫方法和金標試紙條法 快速，簡單，比較容易上手，但干擾多，對產(chǎn)品本身質(zhì)量要求高，常用于大面積篩選方面。 ELISA原理 ? ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。 加入樣品和酶標記物 反應(yīng) 60分鐘 E E E E E E 洗 板，洗去多余的酶標記物 E E E E E E 加入發(fā)色劑，顏色逐漸變藍 S P E E E E 加入停止液，顏色變黃 E E E E 使用中的一些問題 ? 1．樣品吸光度值高于標準曲線最大吸光度值 原因：零標準稀釋錯誤或稀釋液有一定的待測物（抗原或抗體）。 樣品中含有干擾物質(zhì)，而且稀釋液對樣品的 代表性差。 解決：對于第一種情況，可以用樣品中最大吸光度作為零點做曲線。對于后兩種情況，則需對樣品進行適當處理，如稀釋、抽提等。 使用中的一些問題 ? 2．樣品吸光度值低于標準曲線最小吸光度值 原因：待測物含量高于標準曲線最大濃度。 解決：稀釋后再測。 使用中的一些問題 ? 3．最大吸光度值較低（雖可以建立曲線，但重復(fù)性差） 原因：抗體效價降低，或酶活性下降。 酶活性雖未降低，但發(fā)生脫落。 底物變質(zhì)。 固相載體受污染（如灰塵等） 使用中的一些問題 ? 4 影響酶促反應(yīng)的因素 溫度：溫度的變化與蛋白質(zhì)的失活是一對矛盾，溫度低時蛋白質(zhì)不失活，但反應(yīng)時間長。溫度高時反應(yīng)時間短，但蛋白質(zhì)更容易失活。過氧化物酶最適溫度為 15度，但加入非離子洗滌劑后可以適當提高 pH值：因為酶與底物都有許多的極性基團，且在游離狀態(tài)下酶與底物才結(jié)合，游離狀態(tài)不同，所帶電荷不同。 pH值多在中性、弱酸、弱堿性。過氧化物酶對 pH值要求不高，變化 1個單位的范圍基本上沒有影響。 使用中的一些問題 ? 5 操 作 中 影 響 結(jié) 果 的 因 素 ? 試劑必須回到 2024度，而并不是室溫是 2024度就可以。試劑溫度低會導(dǎo)致吸光度低。 ? 標準使用前一定混勻，否則濃度不準，吸光度會變化。 ? 酶標記物稀釋度不夠，酶標記物含量增高，結(jié)果的吸光度會高。 ? 注意不要污染孔底（如不小心手指碰到），否則吸光度值會降低，如果污染，可用鏡頭紙擦凈。 ? 洗板時，洗板次數(shù)的多少與吸光度值的高低是一對矛盾。 如果機洗，因為不能讓注水頭碰到微孔底部，所以有一定的殘留， 應(yīng)多吸幾次，吸光度會稍微降低，但現(xiàn)梯度有。 如果手洗， 250ul洗 3次就可以，注意孔間防止污染。 ? 注意孔不要干燥，否則吸光度會低。 ? 快速讀取，隨時間增長，所有的吸光度值要有所降低。 使用中的一些問題 ? 6 誤 差 的 來 源 隨機誤差：通過建立標準曲線控制在一定的范圍內(nèi) 系統(tǒng)誤差：引起測量值偏向一側(cè)（偏差） 誤差的來源 1 實驗誤差：包括移液誤差、稀釋誤差、回歸誤差、錯分誤差（分離不完全） 系統(tǒng)誤差： a 時間、條件、技術(shù) b 酶標儀的精確度 c 計算中的誤差（回歸誤差、曲線兩端的誤差） 使用中的一些問題 質(zhì)量控制 1 內(nèi)部質(zhì)控：控制隨機誤差（板內(nèi)、批內(nèi)、批間） 2 外部質(zhì)控：控制系統(tǒng)誤差（方法的評定、不同實驗者的比較） 質(zhì)量評價 1 精確度（重復(fù)性） a 變異系數(shù)法 CV=Sn/X 批間和批內(nèi)要求不同，一般是在 10%以內(nèi) ME b 反應(yīng) 誤差關(guān)系法 RER=—— 要求 RER MR 注： ME=各個樣本的吸光度值的標準差 / 樣品總數(shù) MR=各個樣本的吸光度值的和 / （樣品總數(shù) x重復(fù)測定的次數(shù)） 2 靈敏度：等于 X2SD的 OD值在曲線查出的濃度，得下限值。陽性最小檢出指數(shù) DI（ +） =真陽性 /（真陽性 +假陰性） 3 準確度：不準確度 2=（偏差） 2 +（ CV） 2 4 特異性： Y=S/Z （假定 100%的抗原與 50%抗體結(jié)合） S為標準抗原與 50%抗體結(jié)合時濃度 Z為標準抗原類似物與 50%抗體結(jié)合時濃度 陰性最小檢出指數(shù) DI（ — ） = 真陰性 /（真陰性 +假陽性） 使用中的一些問題 剔除的依據(jù) 1 OD值 3Sn 2 RER 3 若重復(fù) 3次，則首先剔除板邊孔（邊緣效應(yīng)） CV正常值 2倍的標準值 洗板 建議至少洗滌 5~6次（每次靜止 3分鐘， ~），以除去固定較弱的反應(yīng)物，減少交叉反應(yīng)或阻止未結(jié)合的免疫反應(yīng)物吸附到載體上，提高靈敏度；或快速洗滌 3~4次，最后一次靜止 3~5分鐘，且注滿洗滌液。 最常用的緩沖液為 PBS緩沖液，其中最好添加硫柳汞鈉鹽，但不添加也可以。 實驗計算結(jié)果 AlogC作圖法： A= a + blogC的函數(shù)關(guān)系，圖形實際不是一條直線，所以 A和 C的相關(guān)系數(shù)較低。 A/AOlogC作圖法： A/ AO = a + blogC的函數(shù)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)仍然低（絕對值小于 ）但計算簡便。 LogitYlog作圖法： LogitY = a + blogC的函數(shù)關(guān)系，相關(guān)系數(shù) 根據(jù) LogitY=Ln（ A/（ AOA））計算各個標準點的 LogitY值。 計算各個標準點濃度對數(shù) logC。 建立 logC與 LogitY回歸方程，求出 a、 b和 r。 根據(jù) C=antilog（ LogitYa） /b計算樣品濃度。 蛋白芯片技術(shù)介紹 Thank you祝大家身體健康！工作順利！電話： 01062155788 62114669 傳真： 01082109402 6211851